O modificare posttranslațională importantă a histonelor este acetilarea grupărilor ɛ-amino pe reziduurile de lizină conservate prezente în cozile amino-terminale ale acestor proteine. Acetilarea neutralizează lizinele încărcate pozitiv și, prin urmare, afectează interacțiunile histonelor cu alte proteine și/sau cu ADN-ul. Acetilarea histonelor a fost asociată de mult timp cu cromatina activă din punct de vedere transcripțional și, de asemenea, implicată în depunerea histonelor în timpul replicării ADN-ului (1, 2). Prima clonare a unei gene de acetiltransferază a histonei (HAT), gena HAT1 a drojdiei, a fost raportată în 1995 (3). Ulterior, s-a sugerat că proteina HAT1 este citoplasmatică și implicată în depunerea histonelor (4), deși lipsa fenotipurilor mutanților hat1 din drojdie, precum și dovezile recente că atât enzima umană cât și cea din drojdie sunt nucleare (ref. 5; S. Tafrov și R.S., lucrare nepublicată), face ca funcția in vivo a HAT1 să fie neclară.
Un progres major în acest domeniu a fost purificarea și clonarea HAT A, o HAT din macronucleul ciliatului Tetrahymena (6). Secvența HAT A a arătat că este similară cu un coactivator transcripțional cunoscut al drojdiei, GCN5. De atunci, numeroase studii au demonstrat că GCN5 (și P/CAF înrudit) sunt HAT-uri conservate a căror activitate pe nucleozomi facilitează inițierea transcripției (revizuit în ref. 7). Este interesant faptul că GCN5 singur poate acetila histonele libere (în special Lys-14 din H3), dar nu și nucleozomii. Acetilarea nucleozomilor de către GCN5 necesită ca acesta să se afle într-unul dintre cele două complexe proteice mari numite Ada și SAGA în drojdie (8). În ultimii câțiva ani, s-a demonstrat că mai multe proteine de mamifere, care nu au legătură cu GCN5, dar care sunt, de asemenea, implicate în activarea transcripțională, au activitate HAT. Printre acestea se numără CBP/p300, TAF250, ACTR și SRC-1 (9-12). Astfel, devine clar că acetilarea histonică a nucleozomilor este o componentă semnificativă a procesului de activare genetică în mai multe etape.
În acest număr al Proceedings, Trievel et al. (13) raportează structura cristalină a domeniului HAT catalitic al GCN5 din drojdia GCN5. Acest domeniu cuprinde reziduurile 99-262 din proteina de 439-aa. O porțiune din structura lor, formată din patru catene β antiparalele (β1-4), urmate de un α-helix (α3) și de o altă catenă β (β5), este prezentată în Fig. Fig.1.1. Această parte a GCN5 este foarte asemănătoare ca structură cu cea a HAT1 din drojdie (14), precum și cu alte două N-acetiltransferaze ale căror substraturi nu sunt histonele, și anume aminoglicozida 3-N-acetiltransferaza (AAT; ref. 15) și serotonina N-acetiltransferaza (16). Toate aceste enzime sunt membre ale unei familii de proteine identificate prin analiza secvenței ca fiind cele care prezintă similitudini cu N-acetiltransferazele cunoscute, cum ar fi GCN5, și, prin urmare, numite superfamilia GNAT (17). Membrii acestei superfamilii au ca trăsătură comună faptul că transferă o grupare acetil de la acetil CoA la o grupare amino primară, deși sunt grupe amino foarte diferite pentru diferitele enzime; de ex, pe grupe ɛ-amino de pe lizine în cazul HAT-urilor, pe grupe α-amino de pe terminațiile N ale proteinelor în cazul unor enzime precum ARD1 sau MAK3, pe zaharuri în cazul AAT (15) și GNA1 (18, 19), sau pe serotonină pentru serotonina N-acetiltransferază (16). Toți membrii superfamiliei GNAT au un motiv conservat numit motiv A (prezentat cu roșu în Fig. Fig.1),1), iar majoritatea au alte două motive conservate numite B și D.
Diagramă cu panglici a GCN5 care arată nucleul conservat întâlnit la patru N-acetiltransferaze și la o N-miristoil-transferază. Motivul A din superfamilia GNAT este indicat cu roșu. Acetyl CoA, așa cum este prezent în HAT1, este modelat în structura GCN5. Sulful din acetil CoA este indicat cu galben.
S-a prezis că motivele conservate din superfamilia GNAT ar fi implicate în legarea acetil CoA, deoarece acesta este singurul substrat pe care aceste diverse N-acetiltransferaze îl au în comun (17). Într-adevăr, structura HAT1 cu acetil CoA legat a confirmat faptul că motivul A este implicat în legarea CoA (14), la fel ca și lucrările structurale cu aminoglicozida 3-N-acetiltransferaza (15) și serotonina N-acetiltransferaza (20). În Fig. Fig.11, acetil CoA a fost modelat în structura GCN5, pe baza poziției sale în HAT1 (13, 14). Acetil CoA este legat într-o despicătură în formă de V, formată între ramurile β 4 și 5. Motivul A foarte conservat al familiei GNAT se leagă de fracțiunea pirofosfat a acetil CoA. Unitățile de pantotenat și β-mercaptoetanolamină ale CoA sunt orientate de-a lungul β4 și sunt legate de aceasta prin legături de hidrogen, imitând astfel o catenă β.
Trievel și colab. (13) propun un mecanism de cataliză de către GCN5. Aceștia sugerează că un reziduu de glutamat (Glu-173) este poziționat pentru a extrage un proton de la o grupare NH3+ de pe lizina care urmează să fie acetilată, astfel încât grupa amino neîncărcată poate efectua apoi un atac nucleofilic asupra carbonului carbonil al grupei tioester reactive a acetil CoA. Fig. Fig.22 prezintă o suprapunere a regiunilor presupusului situs activ al GCN5 (în galben) și HAT1 (în roșu) cu acetil CoA legat. Din nou, observați cât de asemănătoare din punct de vedere structural sunt cele două proteine în această regiune. Conform propunerii lui Trievel et al., Glu-173 din GCN5, în special după reorientarea lanțului său lateral, ar fi suficient de aproape de lizina care intră pentru a efectua cataliză bazică. Într-adevăr, mutația lui Glu-173 în Gln anulează activitatea in vivo și in vitro (13). Nu există niciun reziduu Glu sau Asp în poziția corespunzătoare în HAT1. Observăm, totuși, că Glu-255 sau Asp-256 din HAT1 de pe catena β adiacentă a fantei sunt poziționate astfel încât ar putea îndeplini aceeași funcție catalitică (Fig. (Fig.2).2). Aceste reziduuri nu au fost încă mutate.
Suprapunere a β4-α3-β5 din GCN5 (galben) și a regiunii corespunzătoare din HAT1 (roșu). Proteinele sunt reprezentate ca urme Cα cu acetil CoA legat. Glu-173 din GCN5, despre care se crede că este implicat în cataliză, este prezentat în reprezentare cu bilă și baston, la fel ca și reziduurile Glu-255 și Asp-256 din HAT1.
Este clar din structurile GCN5, HAT1 și ale altor doi membri ai superfamiliei GNAT că acestea au în comun un nucleu conservat, inclusiv locul de legare pentru acetil CoA (Fig. (Fig.1).1). Este interesant faptul că N-miristoil transferaza are o structură similară cu cea a N-acetiltransferazelor discutate mai sus (21, 22), chiar dacă această enzimă transferă o grupare acilă mult mai mare de la myristoil CoA la grupele α-amino ale glicinelor de la extremitățile N ale proteinelor substrat. Pe de altă parte, cloramfenicol acetiltransferaza, care acetilează o grupare hidroxil, nu are o structură similară. Se pare că enzimele GNAT care acetilează grupările amino de pe un set divers de substraturi se leagă toate de acetil CoA într-un mod foarte asemănător și, probabil, au în comun un mecanism catalitic similar. Desigur, aceste enzime vor fi diferite în ceea ce privește regiunile care leagă substratul care urmează să fie acetilat. În ceea ce privește HAT-urile, următorul obiectiv va fi determinarea unei structuri cu un substrat histonic sau peptidic legat de enzimă.
.