Implicații structurale
Rezultatul modificării proteinei mutante care conține cisteină (K41C) cu bromoetilamină este o enzimă foarte apropiată de RNază A de tip sălbatic. Totuși, valoarea kcat/Km pentru cataliză de către RNază A K41S-etilaminocisteină este de numai 8% din cea a enzimei de tip sălbatic. Diferența dintre cele două proteine trebuie să se regăsească în diferențele dintre un grup tioeter și un grup metilen. Deși unghiurile legăturilor C-S-C tind să fie mai ascuțite decât cele ale legăturilor C-CH2-C, această diferență este compensată de lungimea mai mare a legăturilor C-S.3g,14 Modelarea moleculară indică faptul că grupările amină primară din S-etilaminocisteină și lizină pot fi suprapuse cu o precizie de 0,1 Å. O diferență mai semnificativă între S-etilaminocisteină și lizină este preferința lor relativă pentru unghiurile de torsiune stângaci mai degrabă decât pentru cele anti-torsiune.15 Conformația anti a legăturilor CC-CC este favorizată cu aproximativ 0,8 kcal/mol în compușii model.16 Într-adevăr, unghiul mediu de torsiune K41 este de (175 ± 3)° în complexul RNazei A cu vanadatul de 2′,3′-uridină ciclică (U>v), un analog presupus al stării de tranziție (figura 2). Spre deosebire de legăturile CC-CC, conformația gauche a legăturilor CS-CC este favorizată cu 0,05-0,20 kcal/mol.17 Modelarea moleculară indică faptul că legătura CS-CC a unui reziduu S-etilaminocisteină din poziția 41 poate fi în conformația gauche fără a perturba structura proteinei native. Astfel, este probabil ca lanțurile laterale tioeter de la poziția 41 să fie mai puțin rigide și mai puțin extinse decât lanțurile laterale alchilice. Prin urmare, presupunem că cataliza realizată de enzima S-etilaminocisteină nu este la fel de eficientă ca cea realizată de RNază A de tip sălbatic din cauza costului entropic al fixării unui tioeter în conformația all anti.
Structura situsului activ al RNazei A legat de vanadatul 2′,3′-ciclic de uridină. Structura a fost rafinată la 2,0 Å din datele de difracție de raze X și neutroni colectate din cristale crescute la pH 5,3. Lanțul lateral al fenilalaninei 120 și baza uracilului nu sunt reprezentate.
Eficiența catalitică depinde de lungimea lanțului lateral al reziduului 41. Variantele de RNază A care prezintă o grupare amino la capătul unui lanț lateral mai lung decât cel al lizinei sunt catalizatori mai activi decât este RNaza A K41C nemodificată. Astfel, lungimea suplimentară este tolerată în situsul activ. Totuși, enzimele în care o grupare amino în poziția 41 este separată de lanțul principal cu 4 atomi sunt mai active decât cele separate de 5 atomi. Acest rezultat ar putea proveni din entropia conformațională suplimentară sau din unghiurile de torsiune nefavorabile ale lanțurilor laterale mai lungi.
Nu se obține niciun avantaj semnificativ dacă reziduul 41 poate dona o a doua legătură de hidrogen. Grupurile guanidino și acetamidino au potențialul de a interacționa simultan cu mai mult de un oxigen al unei grupări fosforil. De exemplu, o grupare guanidino este utilizată pentru a lega grupările fosforil de către proteina Tat a HIV-118 și de către receptorii artificiali.19 Mai mult, în nucleaza stafilococică și în ribonucleazele din familia T1, o arginină pare să joace rolul lui K41 în RNază A.20 Am înlocuit K41 cu un reziduu de arginină și un reziduu S-acetamidino, care este un analog scurt al argininei. Valorile ΔΔG‡ pentru aceste enzime sunt mai mici decât cele pentru enzimele analoge cu doar o grupare amino primară în lanțul lateral al poziției 41. Astfel, o singură legătură de hidrogen pare să fie suficientă pentru a efectua o cataliză eficientă. Acest rezultat este în concordanță cu complexul cristalin al RNazei A cu U>v (figura 2). Grupul vanadil din U>v este o bipiramidă trigonală aproximativă cu doi oxizi ecuatoriali fără punte, O1V și O3V. Oxigenul O1V acceptă o legătură de hidrogen de la lanțul lateral al glutaminei 11, în timp ce O3V acceptă o legătură de hidrogen de la lanțul principal al fenilalaninei 120. Doar O1V este în poziția de a accepta o legătură de hidrogen de la K41.
Implicații mecaniciste. Rolul catalitic cel mai frecvent atribuit lui K41 este acela de a stabiliza excesul de sarcină negativă acumulat pe oxigenii fosforilici neîmbrăcați în timpul scindării ARN-ului (figura 2). Acumularea de sarcină ar putea avea loc într-o stare de tranziție pentacoordonată (sau un intermediar fosforan) atunci când grupul hidroxil 2′ atacă fosforul, pe drumul spre deplasarea nucleozidului 5′. S-a presupus că această stabilizare are loc prin interacțiuni coulombiene.12c,21 Dar, recent, s-a propus, de asemenea, că stabilizarea are loc prin intermediul unei legături de hidrogen scurte și puternice care implică transferul parțial al unui proton de la K41.22
Caracteristicile principale ale unui reziduu de lizină sunt sarcina sa pozitivă și capacitatea sa de a dona legături de hidrogen. Trei dintre cele 5 enzime semisintetice, precum și K41R au în comun aceste caracteristici. Nu este o chestiune simplă de a face diferența între o interacțiune bazată exclusiv pe forțe coulombiene și una bazată pe legături de hidrogen între două specii încărcate. Ceea ce urmează este cea mai simplă explicație care este în concordanță cu datele din tabelul 1.
Distincția dintre legăturile de hidrogen și forțele coulombiene nu este mai evidentă nicăieri mai mult decât într-o comparație între enzima S-etiltrimetilaminocisteină, care posedă o sarcină pozitivă terminală, dar nu are capacitatea de a dona o legătură de hidrogen, și enzima S-acetamidocisteină, care are o amidă N-H pentru o potențială donare de legături de hidrogen, dar nu are o sarcină pozitivă. Activitatea catalitică scăzută a enzimei S-etiltrimetilaminocisteină contrazice puternic eficacitatea forțelor coulombiene în stabilizarea stării de tranziție. Dacă toate celelalte condiții sunt egale, energia unei interacțiuni sarcină-încărcare scade doar cu inversul distanței. O distanță mai mare între sarcina pozitivă de pe lanțul lateral și oxigenii fosforilului, în comparație cu cea din enzima S-etilaminocisteină, este impusă de grupările metil. Cu toate acestea, este puțin probabil ca această distanță să fie suficient de mare pentru a cauza reducerea observată de >103 ori a kcat/Km, mai ales că cele trei grupări metil ar putea fi ușor de acomodat în vecinătatea oxigenilor fosforilici (figura 2).
Se așteaptă ca puterea unei legături de hidrogen să se coreleze invers cu pKa a protonului donat, în măsura în care legătura de hidrogen implică un anumit grad de transfer de protoni.23 După cum se arată în tabelul 1, creșterile de pKa corespund într-adevăr unor scăderi ale ΔΔG‡ pentru enzimele semisintetice care au lanțuri laterale de lungime comparabilă. Pentru acele enzime semisintetice în care lungimile lanțurilor laterale sunt comparabile cu cele ale lizinei, corelația este, totuși, neliniară. Această lipsă de liniaritate ar putea apărea deoarece pKa al fiecărui lanț lateral depinde de mediul său particular în proteina nativă. Într-adevăr, s-a stabilit că pKa al Lys41 este de 9,0,24 și nu de 10,6, așa cum este indicat pentru ionul de butilamoniu în tabelul 1. Diferite lanțuri laterale pot fi afectate în grade diferite. O altă sursă de neliniaritate, poate mai semnificativă, este faptul că speciile încărcate au tendința de a participa la legături de hidrogen mai puternice decât speciile neîncărcate. Acest fenomen a fost observat în cazul proteinelor25 , precum și al moleculelor mici, inclusiv al aminelor.26 Compararea enzimelor semisintetice cu lanțuri laterale care sunt izosterice, dar care diferă în ceea ce privește sarcina formală, ar trebui să dezvăluie o astfel de tendință. De exemplu, în enzimele S-acetamidinocisteină și S-acetamidocisteină, lanțurile laterale de la poziția 41 sunt identice, cu excepția unuia dintre cei doi heteroatomi atașați la carbonul terminal. Cu toate acestea, diferența în ceea ce privește capacitatea acestor două lanțuri laterale izoloage de a se lega de starea de tranziție este mai mare decât cea așteptată doar din aciditatea lor. Aici, legătura de hidrogen donată de o acetamidină încărcată este cu 4 kcal/mol mai puternică decât cea donată de o amidă neîncărcată. Această valoare este în concordanță cu alte date privind puterea relativă a legăturilor de hidrogen încărcate și neîncărcate în interacțiunile proteină-ligand.21 În cele din urmă, este demn de remarcat faptul că, deși lanțul lateral S-acetamido este lipsit de o sarcină formală și are un pKa relativ ridicat, acesta contribuie totuși (deși modest) la cataliză. Acest rezultat oferă o dovadă suplimentară a importanței pentru cataliză a unei legături de hidrogen donate de reziduul 41.
.