Polimorfismele genetice ale citocromului P450 2D6 (CYP2D6): consecințe clinice, aspecte evolutive și diversitate funcțională

Farmacogenetica care se ocupă cu diferențele moștenite în ceea ce privește țintele medicamentelor și dispoziția medicamentelor sub formă de receptori și transportatori de medicamente se dezvoltă rapid.1, 2, 3, 4, 5 În prezent, cunoștințele noastre sunt cele mai avansate în ceea ce privește influența genelor distribuite polimorfic care codifică enzimele de metabolizare a medicamentelor, deși cunoștințele despre receptorii și transportatorii de medicamente sunt în creștere rapidă. În prezent, cea mai mare importanță asupra diferențelor interindividuale în ceea ce privește răspunsul la medicamente este exercitată de diferențele de capacitate de metabolizare a medicamentelor cauzate de polimorfismul genetic sau de inhibarea sau inducerea metabolismului medicamentelor. Pe lângă interacțiunile medicament-medicament, factorii fiziopatologici și factorii de mediu, genetica enzimelor de metabolizare a medicamentelor joacă un rol esențial pentru înțelegerea diferențelor interindividuale în ceea ce privește răspunsul la medicamente și reacțiile adverse la medicamente. Cel mai mare impact dintre enzimele de metabolizare a medicamentelor este exercitat de citocromii P450, principalele enzime de fază I.6, 7 Dintre acestea, CYP2C9, CYP2C19 și CYP2D6 sunt extrem de polimorfice și reprezintă împreună aproximativ 40% din metabolismul hepatic uman de fază I. În plus, polimorfismele CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 și CYP2C8 contribuie, de asemenea, la diferențele interindividuale în metabolismul medicamentelor. CYP2D6 este probabil cea mai studiată enzimă metabolizatoare de medicamente cu expresie polimorfă la om; polimorfismul său are o mare importanță clinică și a fost primul dintre polimorfii P450 care a fost caracterizat la nivel molecular. În prezent, au fost identificați peste 48 de substraturi medicamentoase diferite pentru această enzimă (tabelul 1), iar CYP2D6 este responsabil pentru aproximativ 25 % din metabolismul medicamentelor cunoscute. Aceasta ar putea fi totuși o ușoară supraestimare, deoarece în trecut au fost căutate în mod specific medicamentele care sunt metabolizate de această enzimă, datorită expresiei sale polimorfice. În prezenta trecere în revistă sunt descrise cunoștințele și consecințele actuale ale geneticii moleculare a CYP2D6, precum și cunoștințele privind impactul asupra tratamentului medicamentos.

Caracteristici generale ale CYP2D6

CYP2D6 este o polipeptidă de 497 aminoacizi. Enzima reprezintă doar un procent mic din toți P450 hepatici, dar rolul său în metabolismul medicamentelor este mult mai mare decât conținutul său relativ (vezi Zanger et al8). Diferitele modele ale enzimei bazate pe structura tridimensională a citocromului P450 BM-3 sau CYP2C5, precum și rezultatele obținute prin mutageneză dirijată pe site diferă foarte mult unele de altele. În ciuda succesului de cristale bine difractate ale CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 și CYP3A4 de mamifere, nimeni nu a reușit încă să obțină cristale bune ale CYP2D6. Se consideră că astfel de cristale sunt necesare pentru a obține un șablon pentru modele cu o rezoluție și o acuratețe suficiente pentru a putea, de exemplu, prezice medicamentele care vor fi substraturi pentru această enzimă. Un astfel de model ar fi de o importanță severă pentru industria farmaceutică, deoarece un design de medicament care să evite compușii care sunt substraturi de mare afinitate pentru CYP2D6 este esențial pentru un produs de succes pe piață.

Substanțele CYP2D6 sunt baze lipofile cu un atom de azot protonabil. Reacția de hidroxilare are loc la o distanță de 5 sau 7 Å față de atomul de azot. Experimentele de mutageneză dirijată indică faptul că Asp301 este aminoacidul cu sarcină negativă responsabil de legarea la azotul substratului.8 În plus, și Ser304, Thr309 și Val370 par să fie implicate în legarea substratului9 , deși sunt necesare modele suplimentare pentru confirmare.

CYP2D6 are o afinitate foarte mare pentru alcaloizi (a se vedea tabelul 1).10 Expresia enzimei, spre deosebire de alți citocromi P450 metabolizatori hepatici ai xenobioticelor, nu este reglată de niciun agent de mediu cunoscut și nu este inductibilă de hormoni cunoscuți. Deoarece nu a fost descris niciun fenotip la subiecții care nu au CYP2D6 sau care au până la 13 copii active ale genei, s-ar putea concluziona că enzima nu are o funcție endogenă majoră. A fost sugerat un rol pentru metabolizarea unor neurotransmițători. Într-adevăr, au fost prezentate dovezi recente că CYP2D6 este o O-demetilază specifică a 5-metoxindoletilaminei11 și, de asemenea, s-a demonstrat că 5-metoxitriptamina12 este un substrat. Pe lângă astfel de substraturi, este probabil ca enzima să aibă un rol major pentru metabolismul constituenților alimentari, în special alcaloizi (a se vedea mai jos).

Acțiunea CYP2D6 asupra substraturilor cu activitate potențială în creier ar implica un fenotip funcțional pe subiecți, adică metabolizatori săraci (PM) lipsiți de enzimă. De fapt, două studii au indicat o relație semnificativă între comportamentul cu ajutorul testelor psihologice și prezența CYP2D6.13, 14 Se pune întrebarea dacă o astfel de activitate este esențială. În mod interesant, Pai et al15 au furnizat recent dovezi că o variantă comună a pseudogenei CYP2D7P ar putea fi exprimată într-o formă activă în creierul uman, dând naștere unui produs enzimatic funcțional care este activ în metabolismul, de exemplu, al codeinei. Rămâne de elucidat dacă acesta reprezintă un produs cu adevărat important din punct de vedere funcțional, deși constatarea ca atare este interesantă.

Primorfismul CYP2D6-Aspecte istorice

Primorfismul CYP2D6 a fost descoperit independent în trei laboratoare diferite. Laboratorul lui Folke Sjöqvist a arătat că metabolismul nortriptilinei și al desimipraminei, care ulterior s-a dovedit a fi substraturi ale CYP2D6, prezenta o variație interindividuală enormă a nivelurilor plasmatice la aceeași doză și au fost identificate două fenotipuri.16 Studii ulterioare ale grupului Sjöqvist folosind gemeni au arătat că diferența era de natură genetică. Bob Smith și colaboratorii săi din Londra au studiat metabolismul a două medicamente antihipersensibile, betanidina și debrisochina, care erau utilizate pentru hipertensiune. Când Bob Smith, în mai 1975, a luat 40 mg de debrisochină, a amețit, a leșinat și a suferit de hipotensiune arterială severă. Un studiu ulterior cu 10 mg de debrisoquină la 94 de subiecți a identificat cele două fenotipuri.17 Michel Eichelbaum din Bonn a studiat efectele antiaritmice ale sparteinei, iar doi subiecți s-au plâns de efecte secundare neplăcute, cum ar fi vedere încețoșată, diploidă, amețeli și dureri de cap. Analiza nivelurilor plasmatice a arătat că aceștia aveau niveluri de 4-5 ori mai mari decât ceilalți, iar cele două fenotipuri au fost publicate în 1978 și 1979.18, 19

Bazele genetice care stau la baza polimorfismului debrisochinei au fost elucidate 10-15 ani mai târziu. Într-un studiu de colaborare între laboratoarele lui Urs Meyers și Frank Gonzalez, anticorpii policlonali CYP2D de șobolan dezvoltați la Basel au fost folosiți ca instrumente pentru a clona ADNc CYP2D6 uman dintr-o bibliotecă de ADNc din ficatul uman λgt 11, iar ADNc exprimat a avut activitatea bufuralol hidroxilază așteptată.20 Utilizând RFLP, laboratorul Meyers a putut confirma modele RFLP modificate în PM pentru debrisochină21 , în timp ce identificarea completă a alelelor CYP2D6*3 și CYP2D6*4 a fost publicată în 1990.22

La sfârșitul anilor 1980 am identificat, în cadrul unei colaborări fructuoase cu Leif Bertilsson și Folke Sjöqvist, un model RFLP la chinezii activi în metabolismul CYP2D6, indicativ pentru PMs la caucazieni23 și, mai târziu, am caracterizat cea mai frecventă alelă CYP2D6 parțial defectă la orientali, CYP2D6*10.24 Întrucât un grup francez s-a opus identificării dimensiunii fragmentelor XbaI chinezești, am reanalizat mai multe probe diferite de ADN prin XbaI RFLP utilizând o densitate mai mică a gelului de agaroză și am găsit unele probe despre care am crezut că au ADN necuprins (a se vedea Ingelman-Sundberg25 pentru mai multe detalii). Cu toate acestea, examinarea originii lor a arătat că acestea proveneau de la persoane foarte rapide pentru metabolismul debrisochinei și au fost identificați subiecți cu până la 12 copii suplimentare ale genei CYP2D6. Aceasta s-a dovedit a fi prima descriere a unei gene active amplificate în mod stabil la om26 și a fost definit termenul de metabolizatori ultrarapizi (UMs).27 Investigațiile ulterioare ale frecvențelor în diferite populații au relevat 30% la etiopieni,28 10% la spanioli și 10% din populațiile din Italia și Turcia, în timp ce UMs sunt neobișnuite (1-2%) în Europa de Nord și practic absente în Asia (a se vedea6 pentru referințe). La etiopieni nu am găsit niciun individ homozigot pentru genele CYP2D6 defecte, ci alele care conțin 2, 3, 4, precum și 5 copii ale genei CYP2D6.28 O situație similară a fost observată și în rândul arabilor saudiți.29 Evaluarea numărului de subiecți purtători de duplicații ale genei CYP2D6 în Europa de Vest relevă faptul că 5,5% dintre europeni poartă mai mult de două copii active ale genei CYP2D6 și sunt UM (tabelul 2).

Polimorfism genetic CYP2D6

Gena CYP2D6 este localizată pe cromozomul 22q13.1. Locusul conține două pseudogene învecinate, CYP2D7 și CYP2D8.30 Evoluția locusului CYP2D uman a implicat eliminarea a trei gene și inactivarea a două (CYP2D7P și CYP2D8P) și inactivarea parțială a uneia (CYP2D6). În prezent, sunt cunoscute mai mult de 46 de alele majore polimorfe diferite ale CYP2D6. Prezența pseudogenelor foarte asemănătoare, situate foarte aproape și purtătoare de mutații dăunătoare, a dus, de exemplu, prin reacții de încrucișare inegale, la formarea multor variante alele CYP2D6, care codifică cel mai adesea produse genetice defectuoase. „Activitatea” locusului CYP2D este ridicată în comparație, de exemplu, cu cea a locusului CYP2C și, prin urmare, multe alele variante s-au format într-o perioadă relativ scurtă de timp. Cele mai frecvente alele variante distribuite în diferite grupuri etnice sunt enumerate în tabelul 3, iar toate alelele variante sunt prezentate pe pagina de pornire a comitetului pentru nomenclatura alelelor CYP umane (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). Alelele variante ale CYP2D6 pot fi clasificate în categorii, care determină o activitate cataxică abolită, diminuată, normală, crescută sau alterată calitativ. Printre cele mai importante variante se numără CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 și CYP2D6*41.

Cea mai frecventă alelă la asiatici (frecvență a alelei de >50%) și, prin urmare, probabil cea mai frecventă alelă CYP2D6 din lume este CYP2D6*10.24 Enzima CYP2D6.10 are o mutație deleterioasă P34S care abolește secvența importantă PPGP necesară pentru plierea P450 și, prin urmare, este foarte instabilă,24 dar are și o afinitate redusă pentru substraturi.31 În rândul negrilor, CYP2D6*17 descrisă pentru prima dată în 199632 este principala variantă de alelă CYP2D6. Ea codifică, pe lângă cele două mutații missense observate la CYP2D6*2, și T107I, care aparent realizează o structură modificată a situsului activ. Aceasta creează o specificitate modificată a substratului33 , care este evidentă in vitro33 , dar și atunci când subiecții cu genotipul CYP2D6*17 sunt fenotipate in vivo34 , 35 În general, activitatea enzimei CYP2D6.17 este mai mică decât cea a enzimei de tip sălbatic.

CYP2D6*41 este o variantă a CYP2D6*2 care are -1584 C în loc de G. Este mai puțin exprimată decât alela CYP2D6*2 corespunzătoare (a se vedea Zanger et al36). Este plauzibil ca -1584G>C să se afle în dezechilibru de legătură cu un alt SNP care cauzează un splicing deficitar al ARNm, deși acest lucru trebuie demonstrat în mod explicit. Efectul in vivo al CYP2D6*41 este totuși destul de pronunțat și subiecții homozigoți pentru această alelă sunt fenotipic ca indivizii cu fenotip intermediar (IM) cu o alelă CYP2D6 deficitară.36

Evoluția locilor CYP2D

Există o diferență drastică între rozătoare și oameni în ceea ce privește numărul de gene CYP2D active. În timp ce șoarecele are nouă gene Cyp2d active diferite37 , omul poartă doar una singură, care, într-adevăr, este absentă la 7% din populația caucaziană (figura 1). Se știe că enzima CYP2D6 are o afinitate foarte mare pentru toxinele vegetale, cum ar fi alcaloizii.10 Este rezonabil să presupunem că șoarecele a păstrat genele active din cauza necesității unui potențial de detoxifiere prin alimentație, în timp ce alimentația mai restrânsă consumată de oameni în trecut, inclusiv capacitatea intelectuală de a transfera informații privind hrana adecvată între generații, a dus la pierderea presiunii de selecție pentru a menține genele active.

Gena CYP2D6 nu este inductibilă în sensul comun prin creșterea expresiei genei de expresie a produsului genic. La Drosophila are loc o selecție selectivă a tulpinilor care trăiesc, de exemplu, în zona cactusului Senita care secretă alcaloizi izochinolinici toxici și numai Drosophila mettleri, dar nici o tulpină de Drosophila melanogaster nu supraviețuiește în această zonă datorită capacității lor de a induce CYP6 și CYP28. 38 O selecție genetică interesantă are loc și la Drosophila fiind rezistentă la insecticide. Din 1930 până în 1960, petele rezistente la insecticide au evoluat rapid. În mod interesant, baza genetică moleculară pare a fi selecția pentru o inserție a unui transpozom (element acord) în regiunea de reglare 5′ a genei Cyp6b care determină o expresie de 40 până la 100 de ori mai mare a produsului genetic.39 Un alt mecanism de dobândire a rezistenței la insecticide la Drosophila este exemplificat de selecția pentru trei mutații cheie în CYP6A2, și anume R335S, L336V și V476L, care fac ca enzima să fie activă pentru metabolizarea DDT.40 O ilustrare a trei mecanisme diferite de răspuns adaptativ față de stresul de substrat este prezentată în figura 2.

În mod similar, am propus ca o astfel de selecție să fi avut loc pentru alele purtătoare de mai multe gene CYP2D6 active în Africa de Nord-Est. Baza acestei selecții ar fi capacitatea enzimei CYP2D6 de a detoxifia alcaloizii, crescând astfel disponibilitatea de alimente potențiale printre purtătorii de mai multe copii ale genei CYP2D6. Acest lucru ar fi foarte benefic pentru supraviețuirea în perioadele de foamete, atunci când doar o parte din populația din această regiune ajunge la maturitate. Examinarea ratei de metabolizare a debrisoquininei la etiopienii care trăiesc în Etiopia în comparație cu etiopienii care trăiesc în Suedia a arătat că etiopienii nativi cu același genotip aveau o metabolizare mai lentă în comparație cu etiopienii din Suedia, în timp ce nu s-au constatat diferențe semnificative în ceea ce privește rata reacțiilor catalitice dependente de CYP2C19, măsurate cu S-mefenitoină.41 Acest lucru poate fi interpretat în modul în care constituenții din alimentele etiopiene, probabil alcaloizi, inhibă activitatea CYP2D6 și că astfel de componente ar putea fi într-adevăr un factor declanșator al selecției genetice. Noi propunem că populația etiopiană s-a extins în urmă cu aproximativ 10 000-20 000 de ani într-o asemenea măsură încât hrana a reprezentat o constrângere importantă. În timpul perioadelor de foamete, a avut loc o presiune de selecție care a favorizat supraviețuirea subiecților capabili să detoxifice toxinele din plante într-o măsură mai mare, crescând numărul de plante capabile să furnizeze hrană utilă (figura 3). Acest lucru a creat o expansiune a subpopulațiilor purtătoare de mai multe copii active ale genei CYP2D6 și, de asemenea, fără gene CYP2D6 inactive. Având în vedere că, de departe, cele mai frecvente variante ale genei CYP2D6 duplicate și multiduplicate sunt CYP2D6*2 și CYP2D6*41, ambele creând două substituții de aminoacizi în comparație cu CYP2D6*1, se poate specula că specificitatea de substrat a acestei forme a enzimei este benefică pentru metabolismul anumitor produse vegetale. Migrațiile ulterioare ale subiecților din nord-estul Africii către zona mediteraneană au dus la frecvența ridicată a UM-urilor în sudul Europei (cf. Tabelul 2).

.