Coronavirusul 2019 (COVID-19) este o boală infecțioasă care a provocat o pandemie globală cu peste 36 de milioane de persoane infectate din aproximativ 200 de țări sau teritorii, cu mai mult de 1 milion de decese până în prezent [Organizația Mondială a Sănătății (OMS), 2020]. Se presupune că agentul cauzal al COVID-19, coronavirusul 2 al sindromului respirator acut sever (SARS-CoV-2), provine de la lilieci, deoarece coronavirusul RaTG13 transmis de lilieci este cea mai apropiată rudă genetică până în prezent (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Mai multe specii au fost studiate pentru a determina rolul lor potențial ca gazde intermediare (Shi et al., 2020). Mai mult, modelele animale care să recapituleze o boală asemănătoare cu COVID-19 sunt considerate o linie de cercetare majoră și sunt necesare pentru dezvoltarea de medicamente terapeutice și compuși profilactici.
În afară de mai multe studii de modelare care propun potențiale specii de animale susceptibile la SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), mai multe infecții experimentale au arătat deja o gamă largă de animale susceptibile. Mai exact, liliacul egiptean de fructe, dihorul, hamsterul sirian auriu, pisica, șoarecii care exprimă enzima de conversie a angiotensinei 2 umanizată (ACE2), șoarecii BALB/c (utilizând un SARS-CoV-2 mutant prin mai multe treceri în culturi celulare) și unele specii de primate neumane sunt permisive la infecția virală, dezvoltând de la boala respiratorie subclinică la ușoară până la moderată (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Din punct de vedere experimental, sensibilitatea câinilor la SARS-CoV-2 este limitată, deoarece animalele inoculate se pot seroconverti parțial (Shi et al., 2020). În schimb, inocularea intranazală la pui, rațe și porci nu a dus la nicio dovadă de infecție (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Porcul este utilizat în mod obișnuit în cercetare datorită similitudinilor existente cu oamenii în ceea ce privește anatomia, genetica, fiziologia și, de asemenea, imunologia. Într-adevăr, este probabil ca experimentele pe porci să fie mai predictive pentru tratamentele terapeutice și preventive la om decât experimentele pe rozătoare (Meurens et al., 2012). Cu toate acestea, având în vedere că porcii nu sunt susceptibili la infecția cu SARS-CoV-2 atunci când sunt inoculați intranazal (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), merită investigată posibilitatea de a dezvolta un model de infectare a porcilor cu acest virus folosind alte căi potențiale de inoculare. Principalul raționament pentru a testa porcii este că receptorul ACE2 al acestei specii este funcțional, fie prin transfectarea ACE2 porcină în celule HeLa (care nu exprimă constitutiv ACE2 umană) (Zhou et al., 2020), fie că pseudoparticulele cu proteina S a SARS-CoV-2 sunt capabile să infecteze celulele renale porcine (Letko et al., 2020). Mai mult, proteina ACE2 este exprimată în toate țesuturile majore ale porcilor, după cum a fost evaluat prin imunohistochimie (Xiao et al., 2020). În consecință, pentru a stabili un model de porc COVID-19 putativ, am investigat efectul diferitelor căi naturale și nenaturale de inoculare a SARS-CoV-2 la porcii domestici (Sus scrofa domesticus).
În acest scop, au fost selectate patru grupuri de cinci purcei convenționali în vârstă de 5 până la 6 săptămâni (Landrace × Large White), care au fost inoculați prin diferite căi: intranazală (IN, 1,5 ml/nostru; volum total de 3 ml), intratraheală (IT, 3 ml), așa cum a fost descris anterior (Garcia-Morante et al, 2016), intramuscular (IM, 1 ml în fiecare parte a mușchilor gâtului; volum total de 2 ml) sau intravenos (IV, 2 ml), cu o doză finală de 105,8 doze infecțioase de cultură tisulară (TCID50) de izolat SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) pentru fiecare animal. Grupurile IT și IV au fost anesteziate cu 10 mg/kg de ketamină și 0,8 mg/kg de xilazină înainte de inoculare. Un pasaj-2 SARS-CoV-2 a fost propagat și titrat în celule Vero E6 (ATCC CRL-1586), urmând același protocol ca și în cazul altor coronavirusuri (Rodon et al., 2019). Doi porci suplimentari au fost utilizați ca martori negativi.
Toate animalele au fost seropozitive față de coronavirusul respirator porcin, așa cum a fost determinat cu ajutorul unui ELISA comercial (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Ținând cont de faptul că nu a fost descrisă nicio reactivitate încrucișată a anticorpilor între alfa- și beta-coronavirus (Okba et al., 2020), animalele au fost păstrate în studiu. Se aștepta o reactivitate inițială împotriva PRCV, deoarece acest virus este omniprezent în efectivele europene de porcine (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Bunăstarea Animalelor al Institutului de Recerca i Tecnologia Agroalimentară (CEEA-IRTA) și de Comisia Etică de Experimentare pe Animale a Guvernului Autonom al Cataloniei și au fost efectuate de personal certificat. Experimentele cu SARS-CoV-2 au fost efectuate în instalațiile de nivel de biosecuritate 3 (BSL-3) ale unității de bioconfinare din cadrul IRTA-CReSA (Barcelona, Spania).
La 2 și 22 de zile post-inoculare (dpi), au fost eutanasiate două și, respectiv, trei animale/grup (IT, IM și IV). Deoarece s-a demonstrat deja că inocularea IN a fost neeficientă pentru a provoca infecția cu SARS-CoV-2 (Shi et al., 2020), porcii inoculați pe această cale au fost eutanasiați în zilele 1 și 2 pi pentru a evalua dovezile unei posibile infecții timpurii tranzitorii în țesuturi. Animalele de control negativ au fost eutanasiate înainte de începerea experimentului. Probele au fost colectate și prelucrate conform descrierii anterioare (Vergara-Alert et al., 2017). Pe scurt, s-au efectuat necropsii complete la toate animalele. Au fost prelevate mai multe țesuturi (cornete frontale, mediale și caudale; trahee proximală, medială și distală; bronhii mari și mici, zone pulmonare craniene, mediodorsale și caudale stângi; rinichi; ficat; inimă și splină), care au fost fixate prin imersie în formalină tamponată neutră 10%, încorporate în parafină și secționate la 3 µm pentru a pregăti lame. Lamele pentru histologie au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE) pentru a evalua eventualele leziuni microscopice. În plus, aceleași țesuturi, plus ileonul, ganglionul limfatic cervical (LN), LN mediastinal, LN mezenteric, bulbul olfactiv, amigdalele, timusul, glanda salivară parotidă, suprarenalele, pancreasul, trunchiul cerebral, pleoapele și măduva osoasă au fost prelevate în mediu Dulbecco’s modified Eagle (DMEM) în tuburi cu bile pentru a efectua detectarea genei SARS-CoV-2 upE prin RT-qPCR (Corman et al., 2020). S-au prelevat, de asemenea, tampoane nazale și rectale (zilnic în prima săptămână și la 14 și 22 dpi) pentru a le analiza în vederea detectării prezenței ARN-ului viral prin intermediul RT-qPCR menționat anterior. Probele de ser recoltate în zilele 0, 14 și 22 pi au fost testate pentru detectarea prezenței anticorpilor împotriva proteinelor SARS-CoV-2 spike S1 + S2 și nucleocapsidă (N) cu ajutorul unor teste ELISA interne (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). De asemenea, s-a efectuat un test de neutralizare a virusului după un protocol anterior cu o modificare minoră (Rodon et al., 2020), diluțiile seriale de seruri și SARS-CoV-2 au fost incubate timp de 1 oră la 37°C înainte de efectuarea testului pe placă.
Toate animalele au fost monitorizate zilnic, dar niciunul dintre ele nu a prezentat semne clinice după inocularea SARS-CoV-2. De asemenea, nicio leziune macroscopică sau microscopică care să poată fi atribuită infecției cu SARS-CoV-2 nu a fost găsită la niciunul dintre animalele studiate din toate grupurile de inoculare, precum și la cele de control (datele nu sunt prezentate).
Niciunul dintre porci nu a prezentat excreție nazală sau rectală de ARN viral. Traheea proximală de la un animal inoculat cu IN a fost pozitivă la 1 dpi pentru ARN viral (Cq = 24,36). Restul țesuturilor de la acest animal și de la restul porcilor au rezultat negative pentru RT-qPCR (limita de detecție a qPCR de 38,6 cicluri).
Până la 14 și 22 dpi, au putut fi detectate niveluri scăzute de anticorpi direcționați împotriva proteinei Spike la toate animalele din grupurile IM și IV (figura 1a). Mai mult, acești porci au prezentat, de asemenea, titluri de anticorpi neutralizanți la 22 dpi (variind de la 74 la 317 SNT50 titlu de diluție reciprocă SNT50) (figura 1b). De asemenea, până la sfârșitul experimentului, s-au constatat niveluri scăzute de anticorpi care vizează proteina N la unul din cele trei animale inoculate prin IM și la toate animalele inoculate prin IV (datele nu sunt prezentate). Este important de remarcat faptul că un singur animal din grupul IT nu a prezentat anticorpi împotriva S, dar a avut anticorpi împotriva proteinei N, precum și titluri de neutralizare (titlu de diluție reciprocă SNT50 de 29) în ziua 0 pi, ceea ce ar putea sugera o potențială reacție încrucișată cu un alt coronavirus care infectează porcii. De remarcat, acești anticorpi împotriva proteinei N au scăzut până la terminarea experimentului, ceea ce sugerează că erau de origine maternă. În plus, acest animal nu a prezentat anticorpi seroneutralizanți la 22 dpi (figura 1b).
Datele prezente indică faptul că SARS-CoV-2 nu a fost capabil să infecteze porcii pe niciuna dintre căile testate, și anume IN, IT, IM și IV. Prin urmare, eforturile noastre confirmă experimentele anterioare care indică lipsa susceptibilității de infectare de către porc (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), deși poate fi utilizat pentru evaluarea imunogenității viitoarelor vaccinuri candidate.
Important este faptul că studiul actual depășește alte studii cu SARS-CoV-2 și porci, deoarece am testat un număr mai mare de căi de inoculare. Cu toate acestea, niciuna dintre ele nu a dus la o infecție productivă la purcei. Un rezultat semnificativ al acestui studiu a fost dovada seroconversiei împotriva glicoproteinei Spike la zilele 14 și 22 pi și prezența anticorpilor neutralizanți la ziua 22 pi la porcii inoculați pe cale parenterală (IM și IV). Având în vedere durata scurtă a experimentului (22 de zile), o astfel de seroconversie subliniază interesul potențial al porcului pentru a fi utilizat în studiile de imunogenitate pentru SARS-CoV-2. De fapt, interesul porcinelor ca model animal adecvat pentru imunologie, precum și pentru fiziologie, farmacologie și chirurgie, aplicabile în medicina umană, este recunoscut pe scară largă (Rothkötter, 2009).
În concluzie, studiul de față confirmă faptul că purceii nu sunt un model animal adecvat pentru COVID-19, dar utilitatea sa potențială ca model pentru imunogenitate în studiile preclinice de dezvoltare a vaccinurilor merită investigată în continuare.
.