Producția eficientă a acidului 3-hidroxipropionic din glicerol de către Klebsiella pneumoniae modificată metabolic

În producția de 1,3-propandiol sau 3-HP din glicerol, acidul lactic este principalul produs secundar care reduce semnificativ randamentul produsului. Prin urmare, s-au făcut încercări de a reduce producția de lactat prin deleția genei care codifică lactat dehidrogenază (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Deoarece ambele reacții care formează 1,3-propandiol și 3-HP concurează pentru substratul lor comun 3-hidroxialdehidă (3-HPA), eliminarea propandiol oxidoreductazei favorizează producția de 3-HP (Ashok et al. 2011). Prin urmare, în acest studiu, genele ldhA și dhaT au fost eliminate pentru a spori producția de 3-HP.

Efectul deficitului de ldhA asupra producției de 3-HP

A fost construită tulpina JJQ01 cu deficit de ldhA și a fost confirmată eliminarea genei ldhA, așa cum se arată în figura S2A. S-au construit tulpinile recombinate Kp4(pUC18-kan-aldH) și JJQ01(pUC18-kan-aldH) și s-au efectuat fermentații de tip feed-batch în bioreactorul de 5 L. Profilurile de creștere celulară, consumul de glicerol și producția de metaboliți sunt prezentate în Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) a produs 18,3 g/L de 3-HP cu un randament de 0,21 mol/mol în 38 de ore, în timp ce acidul lactic a atins 32,2 g/L cu un randament mai mare de 0,34 mol/mol. În plus, s-au produs 17,6 g/L de 2,3-butandiol, 6,1 g/L de 1,3-propandiol și 10,7 g/L de acid acetic. Formarea lactatului crește nu numai costul, ci și dificultatea de a recupera 3-HP, care este un izomer al lactatului. În plus, lactatul este un inhibitor principal al biosintezei 3-HP și 1,3-propandiolului (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Deficiența de ldhA a eliminat în mod eficient formarea lactatului, iar producția de 3-HP a atins 48,3 g/L cu un randament de 0,28 mol/mol, după cum se arată în Fig. 2b. Concentrația și randamentul de 3-HP în această tulpină cu deficit de ldhA au crescut de 1,64 ori și, respectiv, de 33,3 %, în comparație cu tulpina Kp4(pUC18-kan-aldH). Cu excepția formării unei cantități mici de etanol (aproximativ 4 g/L), nu s-a detectat acumularea de piruvat și formiat de către tulpina mutantă ldhA, care aproape că nu au fost observate în cazul utilizării tulpinii de tip sălbatic.

Aceste rezultate au indicat în mod clar că blocarea producției de acid lactic a redirecționat în mare măsură fluxul de carbon către producția de 3-HP. Asimilarea glicerolului prin DhaB a fost semnificativ îmbunătățită, aproape 0,4 mol/mol de glicerol a fost direcționat prin DhaB către 3-HPA, ceea ce a fost în concordanță cu alte studii (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). Reducerea lactatului ar putea scădea toxicitatea pentru celule, a favorizat creșterea celulară și productivitatea 3-HP. Cu toate acestea, reducerea lactatului a sporit, de asemenea, formarea de 2,3-butandiol și 1,3-propandiol, care au atins 21,9 g/L cu un randament de 0,13 mol/mol și, respectiv, 18,5 g/L cu un randament de 0,12 mol/mol. Din cauza deleției ldhA, excesul de NADH derivat din acumularea crescută de 3-HP ar putea promova producția de 2,3-butandiol și 1,3-propandiol în locul lactatului pentru a regenera NAD+ și a menține echilibrul redox. De fapt, formarea etanolului a sprijinit, de asemenea, regenerarea NAD+, ceea ce a dus la un flux mai mare de la piruvat la etanol decât la piruvat.

Efectul deficienței dhaT asupra producției de 3-HP

Deleția de ldhA a sporit dramatic producția de 3-HP, în același timp, producția de 1,3-propandiol a fost, de asemenea, crescută la 18,5 g/L. Ko et al. (2017) au raportat că 43 g/L de 3-HP și 21 g/L de 1,3-propandiol au fost obținute prin reducerea acetatului și a altor subproduse. Deși formarea de 1,3-propandiol aduce beneficii utilizării glicerolului prin regenerarea cofactorului, aceasta reprezintă o parte substanțială a fluxului de carbon din glicerol. Deoarece 1,3-propandiolul și 3-HP concurează pentru același precursor 3-HPA, pentru a limita fluxul la 1,3-propandiol, a fost construită tulpina cu dublă blocare ldhA și dhaT (prezentată în fișierul suplimentar 1: figura S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). Rezultatele fermentării pe loturi hrănite în reactorul de 5 L sunt prezentate în figura 2c. În mod neașteptat, knock-out-ul concomitent al ldhA și dhaT a dus doar la obținerea a 44,5 g/L de 3-HP, chiar dacă randamentul a crescut la 0,32 mol/mol de glicerol. Eliminarea dhaT a dus la reducerea titrului de 1,3-propandiol și a randamentului la 9,9 g/L și, respectiv, 0,07 mol/mol. Dar 1,3-propandiolul a fost în continuare produs în reacția catalizată de YqhD și de alte oxidoreductaze (Ashok et al. 2013). Mai mult, în comparație cu JJQ01(pUC18-kan-aldH), producția de 2,3-butandiol a crescut ușor de la 21,9 la 23,4 g/L, ceea ce indică faptul că fluxul către calea 2,3-butandiolului a crescut pentru a consuma excesul de NADH derivat din reacția catalizată de ALDH. Sinteza 1,3-propandiolului joacă un rol esențial în reglarea echilibrului redox la K. pneumoniae. În cadrul căii de oxidare, formarea unei molecule de acetat din glicerol produce trei molecule de NADH, în același timp cu formarea unei molecule de ATP. În consecință, suprimarea atât a ldhA, cât și a dhaT a redus considerabil capacitatea de regenerare a NAD+, iar mai mult NADH a fost oxidat prin formarea de 2,3-butandiol, ceea ce a dus la creșterea cantității de 2,3-butandiol. Reducerea ratei de aerare (limitarea aportului de oxigen) ar putea spori producția de acetat pentru a furniza mai mult ATP, dar, în același timp, s-a format mai mult NADH, ceea ce a dus la o producție și mai mare de 2,3-butandiol. Cu toate acestea, NAD+ regenerat părea să fie mai puțin decât cel format în reacția catalizată de DhaT, ceea ce a dus la o producție mai mică de 3-HP. Prin urmare, furnizarea unei cantități adecvate de oxigen pentru a genera NAD+ fără a afecta activitatea DhaB și disimilarea glicerolului este esențială pentru producția de 3-HP în fermentația microaerobă.

În acest studiu, nu a reușit să se îmbunătățească 3-HP prin ștergerea genei dhaT. Disimilarea glicerolului este reglată de glicerol dehidrogenaza DhaD, glicerol kinaza GlpK, glicerol dehidrataza DhaB și 1,3-propandiol oxidoreductazele 1,3-PDORs. Rigiditatea punctului de ramificare a glicerolului implică faptul că îmbunătățirea producției de 3-HP prin deleția genelor implicate în împărțirea fluxului de glicerol este dificilă. Ashok et al. (2011) au determinat activitățile inerente ale DhaD, DhaB, ALDH și 1,3-PDORs după deleția genei dhaT. Ei au constatat că activitatea DhaD a fost ușor îmbunătățită, activitatea ALDH a scăzut ușor, iar activitatea DhaB a scăzut semnificativ. Zhang et al. (2008) au analizat, de asemenea, robustețea la punctele de ramificare a căii de disimilare a glicerolului. S-a demonstrat că împărțirea fluxului de carbon între ramura reductivă și cea oxidativă a fost robustă în raport cu condițiile de mediu.

Efectul aerării asupra producției de 3-HP

Studiile noastre anterioare au arătat că starea microaerobă a fost favorabilă producției de 3-HP. În comparație cu procesul anaerob, în fermentația microaerobă, producția de 3-HP a fost semnificativ îmbunătățită datorită nivelului mai ridicat de expresie a aldehidei dehidrogenazei și, în același timp, producția de 1,3-propandiol a fost redusă (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) au raportat că activitatea specifică a glicerol dehidratazei în K. pneumoniae la o rată de aerare de 0,04 vvm a fost cu 59 % mai mare decât cea în absența aportului de aer. Dar, s-a raportat că glicerol dehidrataza poate fi rapid inactivată de oxigen (Toraya 2000; Ruch și Lin 1975) și a afectat semnificativ producția de 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). În plus, coenzima B12, cofactorul pentru DhaB, nu este suficient sintetizată în condiții de aerare ridicată în majoritatea producătorilor naturali de 3-HPA, cum ar fi K. pneumoniae. Huang et al. (2013) și Ko et al. (2017) au arătat, de asemenea, că condițiile foarte aerobe nu au fost benefice pentru producția de 3-HP. Prin urmare, am întreprins experimente preliminare pe loturi hrănite în diferite condiții de aerare și am constatat, de asemenea, că menținerea unei rate ridicate de aerare a fost nefavorabilă pentru producția de 3-HP după ce creșterea celulară a încetat (datele nu sunt prezentate). În cultura pe loturi hrănite a JJQ02(pUC18-kan-aldH), am adoptat o rată de aerare la jumătate din rata inițială atunci când OD650 a fost închisă la valoarea maximă. Profilurile de creștere, glicerol și metaboliți sunt prezentate în Fig. 3, iar săgeata neagră a indicat momentul în care s-a redus rata de aerare (0,5 vvm).

Titrul final de 3-HP a ajuns la 61.9 g/L cu un randament de 0,58 mol/mol în reactorul de 5-L în 38 h. Concentrația de 3-HP și randamentul obținut de JJQ02(pUC18-kan-aldH) au fost de 3,3 și 2,76 ori mai mari decât cele obținute de Kp4 (pUC18-kan-aldH), și de 1,28 și 2,07 ori mai mari decât cele obținute de JJQ01(pUC18-kan-aldH). Rezultatele au arătat că producția atât de 1,3-propandiol, cât și de 2,3-butandiol s-a oprit la 20 h. Cu toate acestea, titrul de 3-HP a continuat să crească, deși rata de producție a scăzut de la acest moment. În ultima parte a fermentației microaerobe, deși s-a regenerat puțin NADH prin formarea de 1,3-propandiol și 2,3-butandiol, o parte din NADH a putut fi regenerată prin lanțul de transport al electronilor, deoarece cel mai eficient mod de regenerare a NAD+ este prin intermediul lanțului de transport al electronilor în prezența oxigenului (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), rezultând o creștere a 3-HP fără o creștere evidentă a 1,3-propandiolului și a 2,3-butandiolului.

300-L scale-up fermentation

Pentru a examina fezabilitatea tulpinii JJQ02(pUC18-kan-aldH) pentru producerea de 3-HP într-un bioreactor mai mare, s-a efectuat o fermentare pe loturi hrănite într-un bioreactor de 300-L, urmând condițiile de fermentare stabilite în fermentorul de 5-L. S-a adoptat o strategie de aerare în două etape; rata de aerare a fost redusă la jumătate în momentul săgeții negre, așa cum se arată în Fig. 4. 3-HP a atins 54,5 g/L cu un randament de 0,43 mol/mol, iar concentrația și randamentul au fost de 12,2 g/L și 0,11 mol/mol pentru 1,3-propandiol, 21,3 g/L și 0,11 mol/mol pentru 1,3-propandiol, 21,3 g/L și 0,5 mol/mol pentru 1,3-propandiol și 0,5 mol/mol pentru 1,3-propandiol.17 mol/mol pentru 2,3-butandiol și 9,3 g/L și 0,11 mol/mol pentru acetat în 51 h (Fig. 4).

În comparație cu rezultatele obținute în reactorul de 5-L, titrul și randamentul molar al 2,3-butandiolului în reactorul de 300-L au crescut în mod evident, acestea fiind similare cu cele obținute cu aceeași tulpină în reactorul de 5-L la o rată de aerare constantă de 1 vvm. Aceasta a presupus că transferul de oxigen în reactorul de 300-L ar putea fi ceva mai mare decât cel din reactorul de 5-L cu o rată de aerare redusă, deoarece unele cercetări au indicat faptul că producția de 2,3-butandiol necesită o rată de aerare adecvată (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). În condițiile de aerare din reactorul de 300-L, expresia enzimelor legate de formarea de 2,3-butandiol și a rezervei de NADH sau a raportului NADH/NAD+ a favorizat producția de 2,3-butandiol, iar expresia DhaB și AldH ar putea fi ușor afectată.

În vederea echilibrului redox, în tulpina dublu-mutantă ldhA dhaT, NADH format în reacția catalizată de ALDH a fost parțial regenerat prin formarea de 2,3-butandiol și alți metaboliți reduși, cum ar fi etanol și succinat, și parțial prin lanțul de transport al electronilor (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Prin urmare, rata de aerare în fermentația cu microaerare a afectat semnificativ produsele finale. În fermentația în reactorul de 300 L, deși rata de aerare a fost redusă la jumătate din cea inițială, situația transferului de oxigen ar putea totuși să difere foarte mult de cea din reactorul de 5 L din cauza caracteristicilor diferite ale transferului de oxigen, ceea ce a fost un subiect tradițional în scalarea bioproceselor. Diferențele în distribuția produselor în diferite reactoare au indicat importanța unui control precis al alimentării cu oxigen, în timp ce doar reducerea ratei de aerare părea prea aproximativă. Cu toate acestea, deși titrul și randamentul de 3-HP au fost ușor diferite față de cele din reactorul de 5 L, extinderea a fost un succes. Deoarece performanța transferului de oxigen în reactorul de 300-L a fost diferită de cea din reactorul de 5-L, era de așteptat ca o reglare mai precisă în continuare a ratei de aerare în reactorul de 300-L să îmbunătățească nivelul de 3-HP.

.