Profilele acizilor grași și modelele lor de distribuție în microalge: o analiză cuprinzătoare a peste 2000 de tulpini din colecția de culturi SAG

O bază de date a profilelor de acizi grași din diverse microalge

Caracterizarea profilelor de acizi grași ale tulpinilor de microalgii SAG a fost realizată prin examinarea acizilor grași cu lanț lung (C-14 – C-24) esterificați în lipide. Au fost analizate în total 2076 de tulpini de cultură din SAG (reprezentând 91% din exploatația SAG). A fost creată o bază de date care conținea toți AF identificați și alți metaboliți hidrofobi. O prezentare generală a tuturor substanțelor identificate în tulpinile de alge analizate este prezentată în tabelul 1. Un total de 86 de substanțe diferite au fost identificate prin spectrometrie de masă, dintre care 76 reprezintă esteri metilici ai AG. Dintre cei 76 de acizi grași, 36 de substanțe au fost identificate prin spectrul lor de masă și prin timpul de retenție în funcție de o substanță standard, iar ceilalți 40 de acizi grași au fost identificați doar prin spectrele lor de masă. Celelalte 10 substanțe rămase au fost identificate, de asemenea, doar prin spectrele lor de masă. În cazul comparațiilor cu o substanță standard, compusul a fost identificat prin comparație cu spectrele de masă cu cea mai mare similaritate cu substanța propusă în biblioteca MS (Nist02 sau Wiley98). În acest fel au fost detectați unii esteri metilici ai AG ramificați, de exemplu 12-metil-14:0 sau 3, 7, 11, 15-tetrametil-16:0. În timp ce pentru majoritatea FAME-urilor au fost disponibile standarde autentice sau referințe MS, pentru alte câteva substanțe a fost posibilă doar identificarea „best hit”. Derivații DMOX au permis identificarea celor 12 FAME-uri rămase. Substanțele neidentificate nu au fost încă verificate cu standarde autentice, care nu sunt disponibile în acest moment. Baza de date completă este prezentată ca fișier suplimentar 1.

Bacteriile din culturile de alge (ca contaminări sau uneori chiar prin simbioză) sunt bine cunoscute și pot fi găsite în tulpinile de cultură din aproape orice colecție de culturi de alge. Doar o mică parte (aproximativ 20%) din tulpinile SAG studiate pot fi în stare axenică. Prin urmare, este posibil ca și conținutul de acizi grași al bacteriilor contaminante să fi contribuit la profilul de acizi grași obținut. Pentru a testa acest lucru, am măsurat metil-15:0 și metil 17:0, care sunt considerați ca fiind markeri pentru contaminările bacteriene . Doar 34 de tulpini din cele 2076 de tulpini analizate conțineau cantități mici de metil-15:0. Această rată scăzută observată a bacteriilor contaminante a fost susținută de controalele microscopice, care sunt de rutină în întreținerea perpetuă a tulpinilor de alge (date neevidențiate). În concluzie, concluzionăm că doar 1-2% dintre tulpini ar fi putut fi contaminate și că există doar o influență minoră a contaminărilor bacteriene asupra profilurilor FA observate în culturile de alge.

În plus, am comparat profilurile FA majore măsurate ale 10 tulpini alese la întâmplare din diferite clase cu datele publicate (tabelul 2), și trebuie remarcat faptul că doar una dintre cele 10 tulpini care au fost alese din datele publicate provine din colecția SAG. Pentru 6 tulpini, profilurile FA au fost foarte asemănătoare. În cazul celor 4 tulpini rămase au fost observate diferențe majore în ceea ce privește gradul de desaturare a FA cu diferite lungimi de lanț, ceea ce poate fi explicat prin diferitele condiții de cultivare utilizate în diferitele studii.

Patronii de compoziție a acizilor grași

Profilele FAME au fost destul de diferite între tulpini. Ca exemplu, profilurile FAME de la patru genuri diferite, și anume Chroococcus (Cyanobacteria), Closteriopsis (Chlorophyta, Trebouxiophyceae), Pseudochantransia (Rhodophyta) și Prymnesium (Chromalveolates, Haptophyta) sunt prezentate în figura 1. Prin urmare, s-a anticipat recuperarea anumitor modele diferite de distribuție a FA între phyla, clase și genuri de microalge. În plus, s-a testat dacă se pot găsi, de asemenea, diferențe în modelele FA pentru grupuri de rang taxonomic inferior, adică între specii din același gen sau chiar între izolate multiple ale aceleiași specii.

2.1 Distribuția a patru PUFA importanți în rândul tulpinilor din colecția de culturi de alge SAG

Modelele de distribuție a FA între și în cadrul celor 17 grupe (phyla sau clase) de microalgii și cianobacterii cuprinse în tulpinile examinate a fost investigată mai în detaliu pentru patru PUFA care prezintă un interes nutrițional ridicat (tabelul 3). Frecvența de apariție a acestor patru PUFA-uri într-un anumit grup de microalge este prezentată în tabelul 3 ca procent de tulpini cu un anumit FA din toate tulpinile examinate.

Pentru că colecția de culturi SAG se concentrează pe alge microscopice din habitatele terestre, Haptophyta, Dinophyta și Phaeophyceae au fost doar slab reprezentate. Prin urmare, este posibil ca modelele de distribuție recuperate în aceste grupuri și în alte grupuri slab reprezentate să nu fie reprezentative pentru întregul grup. De exemplu, pentru Phaeophyceae au fost disponibile în principal forme microscopice (de exemplu, Ectocarpus și genul de apă dulce Bodanella), iar tulpinile Rhodophyta examinate au acoperit în principal forme de apă dulce sau forme din habitate terestre (de exemplu, Porphyridium). Deși diatomeele sunt foarte diverse în habitatele terestre, eșantionul mic examinat de tulpini de diatomee disponibile (18) nu reprezintă nici pe departe în mod adecvat acest grup, care este probabil cel mai bogat în specii de alge. De asemenea, pentru fiecare dintre cele două clase de Stramenopile (alge heteroconte), Phaeothamniophyceae și Raphidophyceae, doar două tulpini sunt menținute la SAG și, prin urmare, nu sunt discutate în continuare aici. În mod similar, există doar o singură tulpină de Chlorarachniophyta (supergrupul Rhizaria) în SAG.

Acidul PUFA cu lanț foarte lung docosahexaenoic (DHA, 22:6(4Z, 7Z, 10Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) a fost al treilea cel mai frecvent FA, prezent în 15 din cele 20 de grupuri examinate (tabelul 3). În Dinophyta, Haptophyta și Euglenoids, tulpinile care conțin DHA au fost deosebit de frecvente și DHA a fost găsit acolo în procente relativ ridicate din conținutul total de FA, adică în 60% sau mai mult din aceste tulpini proporția de DHA a fost mai mare de 5%. În singura tulpină dinofită studiată de Ceratium horridum, proporția de DHA a fost chiar de 29,3%. În celelalte grupuri, DHA a fost găsit în frecvențe destul de scăzute și, de asemenea, în cea mai mare parte în proporții destul de mici, adică mai puțin de 1% din conținutul total de acizi grași. Deși DHA a fost găsit în Cryptophyta și Bacillariophyceae în aproximativ fiecare a cincea tulpină, procentul său din conținutul total de acizi grași a fost mai mic de 5%, cu excepția lui Cryptomonas baltica SAG 18.80 (Cryptophyta), unde a fost de 13,7%. În ciuda faptului că DHA a fost găsit în frecvențe destul de scăzute în algele verzi (Chlorophyta), al doilea cel mai mare conținut de DHA dintre toate tulpinile SAG, 18,9% din totalul FA, a fost găsit în clorofita Chlorococcum novae-angliae SAG 5.85, urmată de trebuiofita Prototheca zopfii SAG 263-8 cu 14,2%. Împreună, aceste constatări sunt în concordanță cu cantitățile de DHA descrise anterior pentru grupuri specifice de alge .

Acidul Eicosapentaenoic (EPA, 20:5(5Z, 8Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)) a fost unul dintre cele mai frecvente PUFA-uri, găsit în toate cele 17 grupuri acoperite de studiul nostru (tabelul 3). Tulpinile care conțin EPA au fost deosebit de frecvente în Eustigmatophyceae, Glaucophyta, Xanthophyceae și Rhodophyta. Cele mai mari proporții de EPA din conținutul total de acizi grași au fost înregistrate în Rhodophyta, aproximativ 81% dintre tulpini prezentând mai mult de 10% EPA. Cele mai mari valori au fost de 52,4% la Compsopogonopsis leptoclados SAG 106.79 și de 44,9% la Acrochaetium virgatulum SAG 1.81. De asemenea, tulpinile a trei specii de Porphyridium conțineau cantități ridicate de EPA (31,2% în P. sordidum SAG O 500, 27,5% în P. aerugineum SAG 110.79, 26,7% în P. purpureum SAG 1380-1a). Acest lucru este în concordanță cu un raport privind P. cruentum care sugerează că algele roșii sunt o sursă bogată de EPA . În ciuda faptului că EPA a fost găsit destul de frecvent în Glaucophyta, doar aproximativ jumătate din toate tulpinile au avut proporții de EPA mai mari de 10% (maxim 31,1% în Glaucocystis nostochinearum SAG 28.80). Acest lucru este în concordanță cu un alt studiu care a arătat cantități ridicate de EPA (pe lângă ARA) în glaucofita Cyanophora paradoxa . Cel mai mare procent (87%) de tulpini cu o proporție de EPA mai mare de 10% a fost înregistrat în Dinophyta, dar cu un maxim de doar 24,3% în Pyrocystis lunula SAG 2014. În Euglenoide, Xanthophyceae și Eustigmatophyceae, aproximativ 67% din toate tulpinile au avut o proporție EPA mai mare de 10%, cu valori maxime de aproximativ 31% (31,4% în Heterococcus fuornensis SAG 835-5, 31,6% în Euglena proxima SAG 1224-11a) și 34,6% în Goniochloris sculpta SAG 29.96. EPA a fost găsit rar și în principal în cantități nesemnificative (< 5%) în majoritatea algelor verzi, dar trei tulpini au avut un conținut excepțional mai mare de aproximativ 20% din totalul FA (24,2%, Chlorella sp. SAG 242.80; 24,0%, Chlamydomonas allensworthii SAG 28.98; 22,3%, Cylindrocapsa involuta SAG 314-1). EPA a fost singurul AF recuperat din Chlorarachnion repens SAG 26.97 (Chlorarachniophyta). Faptul că Xanthophyceae și Eustigmatophyceae conțin EPA în proporții relativ mari, în timp ce algele verzi rareori acumulează EPA susține studiile anterioare.

Acidul arahidonic (ARA, 20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)) a fost găsit cel mai frecvent în Phaeophyceae, unde a fost prezent în toate tulpinile, cu excepția unei tulpini investigate (tabelul 3); în aproximativ 54% din toate tulpinile de Phaeophyceae, proporția de ARA a fost mai mare de 10%, dar cu un maxim de doar 17,7% în Halopteris filicina SAG 10,96. ARA a avut cea mai mare proporție de FA total în Rhodophyta; acolo chiar și aproximativ 77% din toate tulpinile au avut un conținut de ARA mai mare de 10%, cu un maxim de 68,3% în Pseudochantransia sp. SAG 19.96. În mod interesant, conținutul de ARA a fost destul de ridicat, dar variabil între cele opt izolate multiple examinate ale rodofitei Porphyridium purpureum. În timp ce proporția medie de ARA a fost de aproximativ 31% în șase tulpini, aceasta a fost de doar 3,8% în SAG 1380-1d, dar de 44,5% în SAG 1380-1e. Nu avem încă nicio explicație pentru această variație; ambele tulpini au fost izolate din habitate marine și sunt păstrate în aceleași condiții de cultură. Proporții ridicate de ARA (precum și de EPA) au fost deja găsite ca fiind caracteristice unei alte specii de Porphyridium cruentum . ARA a fost prezent în aproximativ jumătate din toate tulpinile de euglenoide investigate și cu proporții relativ ridicate din conținutul total de AG, adică aproximativ o treime din tulpini au prezentat mai mult de 5% ARA, cu valori extraordinar de ridicate de 41,3% și 34,3% la Rhabdomonas incurva SAG 1271-8 și Khawkinea quartana SAG 1204-9. Interesant este faptul că o altă tulpină din aceeași specie K. quartana, SAG 1204-9, a avut un conținut de ARA mai mic de jumătate (13,3%), iar la alte cinci specii de Rhabdomonas nu a fost detectat niciun ARA. Acest lucru demonstrează că conținutul de AF poate fi destul de variabil între speciile aceluiași gen și chiar între mai multe izolate ale aceleiași specii. Deși aproximativ jumătate din toate tulpinile examinate pentru Xanthophyceae și Eustigmatophyceae conțineau ARA (tabelul 3), acestea aveau acest FA în proporții relativ scăzute. Doar un sfert dintre tulpinile de Xanthophyceae care conțin ARA au prezentat mai mult de 5%, iar în cazul Eustigmatophyceelor nici măcar nicio tulpină nu a atins 5%. ARA a fost rar întâlnit în algele verzi, și anume cu o frecvență medie de aproximativ 14% în phyla Chlorophyta și Streptophyta, cu excepția algelor verzi prasinofite, unde ARA a fost prezent în 42,9% din toate tulpinile (tabelul 3). Cu toate acestea, au existat câteva exemple unice de alge verzi cu un conținut extraordinar de ridicat de ARA, și anume 73,8 % (corespunzând la 102 μg/mg de greutate uscată, cel mai ridicat conținut de ARA detectat în toate tulpinile SAG investigate) în clorofita Palmodictyon varium SAG 3.92, urmată de 52,9 % în clorofita Trochisciopsis tetraspora SAG 19.95 și de 51,8 % în trebouxiofita Myrmecia bisecta SAG 2043. Faptul că s-a constatat un conținut ridicat de ARA în această din urmă tulpină este în concordanță cu faptul că a fost găsită o rudă apropiată cu Parietochloris incisa (syn. Lobosphaeropsis incisa, Myrmecia incisa) . P. incisa a fost atribuită ca fiind o „microalgă oleaginoasă” și cea mai bogată sursă vegetală de ARA cunoscută până în prezent, datorită capacității sale de a acumula cantități mari de ARA (până la 59% din conținutul total de FA) . În mod interesant, tulpina SAG de P. incisa (Lobosphaera incisa SAG 2007) a avut cu 13,2% un conținut de ARA mult mai mic (tabelul 2).

Acidulγ-Linolenic (GLA, 18:3(6Z, 9Z, 12Z)) a fost al treilea cel mai frecvent AF în eșantionul studiat de tulpini de microalgii SAG, lipsind doar în Haptophyta, Dinophyta și Euglenoide (tabelul 3). Acesta a fost detectat cel mai frecvent în două linii de alge verzi, prasinofite și Streptophyta. Cu toate acestea, la prasinofite, GLA a fost prezent doar la unul din cele cinci genuri disponibile pentru acest grup, Tetraselmis, și acolo în 12 din cele 17 tulpini disponibile și în proporții variabile, adică 0,5 – 7,3% din conținutul total de AG. În Streptophyta, GLA a fost distribuit pe scară mai largă, și anume a fost detectat în 17 din cele 41 de genuri examinate. Distribuția GLA a fost destul de variabilă în cadrul tulpinilor și speciilor unui anumit gen de streptofite, similar cu constatările privind ARA în alte genuri. Procentaje relativ ridicate de GLA au fost găsite în speciile/străini de Closterium (16,5% în C. baillyanum SAG 50.89, 8% în C. lunula SAG 7.84), dar GLA nu a fost găsit în celelalte 12 tulpini din acest gen. În mod similar, în numeroasele tulpini disponibile pentru Cosmarium (25) și Micrasterias (16), GLA a fost găsit doar în 11 și, respectiv, 2 tulpini. Cele mai mari procente de GLA au fost găsite în clasa de alge verzi Chlorophyceae (29,9% în Deasonia multinucleata SAG 25,95, 28,5% în Desmodesmus multiformis SAG 26,91) și în Cyanobacteria (24,8% în Spirulina maxima SAG 84,79). În aproximativ o treime (32%) din toate tulpinile de clorofite GLA, acest AF a avut procente de 5% și mai mari. Distribuția GLA la cianobacterii a fost mai degrabă neuniformă, și anume, cele 27 de tulpini de cianobacterii cu GLA au fost limitate în principal la trei genuri, Calothrix (8 tulpini), Microcystis (7 tulpini) și Spirulina (6 tulpini). De asemenea, în cadrul fiecăruia dintre aceste genuri, procentajele de GLA au fost destul de variabile, de exemplu, la Spirulina, acestea au variat de la 4,6% la 24,8%, iar trei tulpini au fost lipsite de GLA. Compoziția FA a fost utilizată anterior pentru a discrimina cianobacteriile în izolate și probe naturale la nivel generic. Pentru a discrimina speciile de cianobacterii, ca marker suplimentar, compoziția de hidrocarburi a fost utilizată într-un studiu anterior, dar în studiul nostru nu am reușit să detectăm nicio substanță din acest grup . Este interesant faptul că GLA a fost singurul AF care a fost detectat în mai mult de trei din cele 223 de tulpini examinate. Prin urmare, tulpinile de cianobacterii SAG pot fi împărțite, în linii mari, în cele cu GLA prezent (câteva genuri) și cele în care aproape că nu au fost prezente PUFA-uri. Acest lucru corespunde constatărilor anterioare care au descris o bipartiție a cianobacteriilor, independent de poziția lor taxonomică, în genuri care produc C-18 PUFA și cele care nu produc .

Genul de prasinofite Tetraselmis a prezentat un exemplu interesant pentru a testa variația FA între izolate strâns înrudite. Nouă tulpini atribuite acestui gen au fost izolate din aceeași localitate (marină) și considerate ca fiind aceeași specie de către izolator (U.G. Schlösser, com. pers.). Numai în două tulpini a fost prezent DHA, dar în urme foarte mici (0,3% și 0,4%). În schimb, ARA și GLA au fost găsite în toate izolatele, cu procente variind de la 0,8% la 2,7% și, respectiv, de la 0,5% la 7,3%.

2.2 Analiza modelelor de distribuție a FA

Compoziția detectată a acizilor grași (FA) din cele 2076 de tulpini investigate a fost analizată statistic pentru a testa dacă există anumite modele de distribuție a FA între diferitele grupuri de alge investigate, care pot corespunde relațiilor filogenetice ale acestora. Într-un prim set de trei analize (niveluri taxonomice superioare) a fost testat 1) dacă modelele de distribuție a FA pot reflecta diferențe între phyla de alge derivate din endocitobioza primară (supergrupa Plantae) sau secundară (Chromalveolates, Euglenoide) în comparație cu cianobacteriile care reprezintă originea plastidică, 2) distincția dintre phyla în cadrul supergrupului Plantae (Chlorophyta, Streptophyta, Rhodophyta/Glaucophyta) și 3) principalele linii evolutive (clase) din cadrul Chlorophyta. Un al doilea set de analize s-a axat pe nivelul generic, și anume s-a testat dacă separarea genurilor, așa cum a fost sugerată pe baza analizelor anterioare ale secvenței ADNr 18S sugerate pentru Chlamydomonas s.l., Chlorella s.l. și Scenedesmus s.l., se reflectă în modelele de distribuție a FA. Pentru primul set de analize, numeroasele specii (266) care au fost reprezentate sub formă de tulpini multiple (de exemplu, Chlamydomonas moewusii, 28) au trebuit să fie reduse la o singură tulpină pentru fiecare specie pentru a evita distorsiuni. Aceasta a inclus, de asemenea, tulpinile multiple neidentificate la nivel de specie, adică etichetate cu „sp.” în locul unui nume de specie (de exemplu, Chlorogonium sp., 26). Tulpinile de Chlorophyta din cadrul SAG au fost deosebit de bogate în astfel de tulpini multiple. De asemenea, au fost excluse acele tulpini în care a fost detectată o singură AF. Acest lucru a redus numărul total de tulpini luate în considerare în calculele noastre la 1193. Tulpinile au fost apoi împărțite în unsprezece grupuri care corespund aproximativ filoane sau clase (Fișier suplimentar 2). Tulpinile aparținând Chlorophyta (61 % din toate tulpinile investigate) au fost ulterior subdivizate în cele trei clase, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae și Ulvophyceae, în timp ce tulpinile de alge verzi SAG prasinofite (1,7 % din toate tulpinile Chlorophyta luate în considerare) au fost excluse din analize, deoarece acestea cuprindeau doar foarte puține specii (10). Tulpinile de Glaucophyta (15) și Rhodophyta (81) au fost tratate colectiv ca o unitate compozită. Rhizaria – Chlorarachniophyta, a fost reprezentată doar de o singură tulpină și, prin urmare, a fost omisă din analizele statistice.

Analize la niveluri taxonomice superioare

A fost testat dacă modelele de distribuție a compoziției FA pe tulpinile investigate delimitează cele trei „supergrupuri” de alge eucariote, Plantae, Chromalveolates și Excavates (Euglenoids), și cianobacteriile între ele. Supergrupul Plantae cuprinde exclusiv eucariote cu plastide derivate din endocitobioza primară, adică o cianobacterie a fost transformată într-un organit prin absorbție și retenție de către celula gazdă, urmată de pierderea unei mari părți din genomul său . Algele cromalveolate, precum și Euglenoidele (singura linie algală de Excavates) și-au dobândit plastidele prin endocitobioză secundară de la o rodofită și, respectiv, de la o algă verde . Pentru a lua în considerare un număr aproape egal de tulpini pentru toate cele patru grupuri, au fost selectate în mod aleatoriu 100 de tulpini de Plantae, Chromalveolates și Cyanobacteria, ceea ce reprezintă un număr foarte apropiat de numărul total de tulpini de euglenoide luate în considerare (73). Ordonarea care a rezultat din CVA (Canonical Variates Analysis, analiza discriminantă multigrup) a evidențiat o diferență puternică între cianobacterii/ endocitobioza primară (Plantae) și cele două grupuri care reprezintă endocitobioza secundară (Chromalveolates/Euglenoids) (figura 2). Diferența observată a fost susținută fără excepție de testele de semnificație neparametrice pentru date multidimensionale (NP-MANOVA și ANOSIM). În urma SIMPER, cea mai mică disimilaritate observată (63,55%) a fost între Cyanobacteria și Plantae, în timp ce cea mai mare (77,29%) a fost între Plantae și Chromalveolates. Prima variabilă canonică (CV1) a implicat 99,99% din toate diferențele posibile între cele patru grupuri, prin urmare am examinat posibilele corelații între această axă și FA. Patru AF au fost corelate în mod semnificativ și exclusiv cu prima variabilă canonică (CV1), și anume 16:0 (ρCV1 = -0,61/p < 0.001), 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,46/p < 0,001), 9-octadecanamid (ρCV1 = 0,41/p < 0,001) și 18:1(9Z) (ρCV1 = -0,17/p = 0,001). Într-o a doua analiză s-a testat dacă modelele de distribuție a FA disting phyla din supergrupa Plantae, adică cele două linii de alge verzi, Chlorophyta și Streptophyta , și grupul compozit Rhodophyta/Glaucophyta. Deoarece acesta din urmă a fost, cu 54 de tulpini, cel mai mic grup, a fost comparat cu eșantioane aleatorii la fel de mari din fiecare dintre Chlorophyta și Streptophyta (tabelul 3). Diagrama de ordonare a unui CVA din totalul de 162 de tulpini investigate a separat în mod clar grupul Rhodophyta/Glaucophyta de ambele filoane de alge verzi (figura 3). CV1 a implicat 79% din toate diferențele posibile și chiar și CV2 a fost cu 21% deloc neglijabilă. Testele de semnificație, NP-MANOVA și ANOSIM, au susținut distincția tuturor celor trei grupuri. SIMPER a arătat că grupul compozit Rhodophyta/Glaucophyta este destul de diferit de ambele filoane de alge verzi, adică au existat disimilitudini de 70,55% și, respectiv, 71,53% cu Chlorophyta și Streptophyta. Cea mai mică disimilaritate (55,41%) dintre cele trei grupuri testate a fost între Chlorophyta și Streptophyta. Au existat cinci FA corelați semnificativ și exclusiv cu CV1, și anume 18:3(9Z, 12Z, 15Z) (ρCV1 = 0,77/p < 0,001), 20:4 (ρCV1 = -0.49/p < 0,001), 20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) (ρCV1 = -0,59/p < 0,001), 18:1(9Z) (ρCV1 = 0,30/p = 0,001) și 16:0 (ρCV1 = -0,56/p = 0, 001). Doi FA au fost corelați exclusiv cu CV2, adică au discriminat Chlorophyta și Streptophyta, 18:1(9Z) (ρCV2 = -0,4477/p < 0,001) și 9-octadecanamid (ρCV2 = 0,34/p < 0,001). Fracțiunea de departe cea mai mare din toate tulpinile luate în considerare (60,3 %) provenea din Chlorophyta, ceea ce a făcut interesant să se testeze dacă modelele de distribuție a FA pot discrimina între cele trei clase de Chlorophyta, Chlorophyceae, Trebouxiophyceae și Ulvophyceae. Ulvophyceae a fost cea mai mică dintre cele trei clase, cu doar 49 de tulpini și, prin urmare, pentru analizele statistice au fost utilizate eșantioane aleatorii de aproape aceeași mărime (54) din fiecare dintre celelalte două clase. CVA nu a evidențiat grupuri distincte, adică tulpinile analizate au avut tendința de a forma trei grupuri care corespund celor trei clase de alge verzi, dar cu o suprapunere considerabilă între ele (figura 4). Cu toate acestea, cele trei clase s-au dovedit a fi semnificativ distincte una de cealaltă atât în testele de semnificație utilizate, cât și în SIMPER. Acestea din urmă și analizele de corelație au permis să se ia în considerare 9-octadecanamidul (ρCV1 = -0,58/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) și FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0,001; ρCV2 = -0,22/p < 0,010) și FA 18:2(9Z, 12Z) (ρCV1 = -0,44/p < 0.001; ρCV2 = -0,53/p < 0,001) ca fiind singurele variabile care discriminează bine Ulvophyceae de Chlorophyceae/Trebouxiophyceae și, respectiv, Trebouxiophyceae de Ulvophyceae/Chlorophyceae.

Analize la nivel generic

Cele trei analize anterioare au arătat că relațiile filogenetice la nivel de filoane și clase între grupurile de alge au fost reflectate în modelele de distribuție a acizilor grași folosind un eșantion mare de tulpini. Prin urmare, într-un al doilea grup de analize, am testat dacă diferențele în modelele de distribuție a FA pot rezolva aceeași distincție a genurilor ca în analizele secvenței genei ARNr. Pentru a testa acest lucru, am selectat trei genuri care sunt utilizate pe scară largă în aplicațiile biotehnologice și care sunt bine reprezentate de tulpini SAG, și anume Chlorella s.l., Scenedesmus s.l. și Chlamydomonas s.l.. Analizele recente ale secvenței genei ARNr18S au arătat că fiecare dintre cele trei specii reprezintă ansambluri para- sau polifiletice care cuprind mai multe genuri distincte. Pentru Chlamydomonas am selectat 17 specii (53 de tulpini), dintre care 9 au fost reprezentate de mai multe tulpini (de exemplu, C. reinhardtii, 16), care au fost distribuite în cinci linii/clase independente (= genuri) în filogenia 18S rDNA. Pentru a reprezenta mai bine clada „Oogamochlamys”, au fost incluse și două tulpini din colecția UTEX (2213, 1753). Ordonarea NMDS a separat clar membrii cladei „Reinhardtii” (dreapta sus în figura 5), cu excepția a trei tulpini, de cei din clada „Chloromonas” (stânga jos în figura 5). Cu toate acestea, grupul „Chloromonas”, așa cum reiese din modelele FA, a inclus, de asemenea, cele trei tulpini investigate din cladele „Moewusii” și patru din cladele „Oogamochlamys”, ceea ce a fost în contrast cu filogeniile ADNr 18S din . De asemenea, în contrast cu filogeniile ADNr, analizele FA au divizat genul Lobochlamys, adică L. culleus a făcut parte din grupul „Chloromonas”, în timp ce L. segnis a aparținut grupului „Reinhardtii”. Tulpinile de Oogamochlamys au fost, de asemenea, separate pe ambele grupe FA, spre deosebire de atribuirea lor ca specii, așa cum se bazează pe analizele ADNr 18S.

Speciile și tulpinile atribuite anterior unui singur gen Scenedesmus s-au dovedit a fi de fapt distribuite pe mai multe genuri prin analize ale secvenței genei ARNr. De exemplu, genul Acutodesmus a fost segregat de Scenedesmus . O diagramă de ordonare NMDS a modelelor de distribuție a FA a evidențiat o tendință a tulpinilor studiate de a fi distribuite în două grupuri, și anume un grup de 8 tulpini de Acutodesmus (incluzând în principal mai multe tulpini de A. obliquus) a fost clar separat de un alt grup care conținea în principal tulpini de Scenedesmus s.str. (figura 6). Tulpinile multiple de S. vacuolatus au fost grupate împreună cu alte patru tulpini din acest gen, cu excepția tulpinii SAG 211-11n, care era aproape de grupul Acutodesmus. Cu toate acestea, tulpinile multiple de A. obliquus au fost distribuite în ambele clustere (figura 6). Șapte tulpini de A. obliquus au format în principal clusterul Acutodesmus, în timp ce alte cinci tulpini de A. obliquus s-au grupat împreună cu tulpini de Scenedesmus s.str. Acest lucru înseamnă că în cadrul aceleiași specii de alge verzi, A. obliquus, există două modele distincte de FA. Amprentele AFLP au arătat deja o variație genetică extinsă între tulpinile multiple de A. obliquus, în timp ce comparațiile secvenței ADNr ITS2 au demonstrat conspecificitatea tulpinilor multiple, cu excepția SAG 276-20 (T. Friedl, observație nepublicată). Prin urmare, constatarea faptului că tulpinile de A. obliquus sunt separate în două grupuri de tip FA favorizează ideea că diferențele genetice rezolvate prin AFLP pot corespunde unor proprietăți fenotipice diferite. În consecință, poate fi esențial să se înregistreze cu atenție ce tulpină a fost utilizată în orice aplicație. Deși s-a constatat că tulpina SAG 276-20 nu aparține aceleiași specii, A. obliquus, tiparul său FA sugerează că ar putea fi totuși un membru al Acutodesmus, deoarece a fost grupată în grupul Acutodesmus (figura 6).

Chlorella vulgaris constituie un alt exemplu în care a fost detectată o variație genetică extinsă între tulpini multiple ale aceleiași specii prin analize AFLP . Cele 15 tulpini SAG multiple de C. vulgaris au fost comparate cu alte 19 tulpini de Chlorella și tulpini asemănătoare cu Chlorella, adică cu cele mai apropiate rude ale acestora, așa cum rezultă din filogenia ADNr 18S, C. sorokiniana și C. lobophora, membre ale cladei Parachlorella sensu, precum și cu tulpini mai îndepărtate, adică din cladele Watanabea și Prasiola sensu . Ordonarea NMDS bazată pe modelul de distribuție a FA nu a arătat aproape nicio variație în cadrul tulpinilor multiple de C. vulgaris și le-a grupat împreună, cu excepția tulpinii SAG 211-1e (figura 7). Un alt grup îndepărtat de C. vulgaris a fost format de membri ai cladei Watanabea, în timp ce algele asemănătoare Chlorella din clada Prasiola nu au fost grupate împreună.