Reglarea enzimelor de conversie a acetatului și a acetil-CoA în timpul creșterii pe acetat și/sau glucoză la arheonul halofilic Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui a format acetat în timpul creșterii aerobe pe glucoză și a utilizat acetatul ca substrat de creștere. Pe amestecuri de glucoză/acetat s-a observat o creștere diauxică, glucoza fiind substratul preferat. S-a analizat reglarea activităților enzimatice legate de metabolismul glucozei și al acetatului. S-a constatat că atât glucoza dehidrogenaza (GDH), cât și acetil-CoA sintetaza formatoare de ADP (ACD) au fost reglementate în perioadele de consum de glucoză și de formare de acetat, în timp ce atât acetil-CoA sintetaza formatoare de AMP (ACS), cât și malat sintetaza (MS) au fost reglementate în mod negativ. În schimb, în timpul perioadelor de consum de acetat s-a observat o reglare ascendentă a ACS și MS și o reglare descendentă a ACD și GDH. MS a fost, de asemenea, crescută în timpul creșterii pe peptide în absența acetatului. Din aceste date, concluzionăm că un ACD indus de glucoză catalizează formarea acetatului, în timp ce activarea acetatului este catalizată de un ACS indus de acetat; atât ACS, cât și MS sunt aparent induse de acetat și reprimate de glucoză.

1 Introducere

Diverse archaea halofile, inclusiv Haloarcula marismortui, se dezvoltă pe bază de glucoză, care este degradată prin intermediul unei căi Entner-Doudoroff (ED) modificate, semifosforilate . S-a demonstrat că în timpul creșterii exponențiale pe glucoză se formează cantități semnificative de acetat. Studii recente indică faptul că formarea de acetat din acetil-CoA în archaea halofilă este catalizată de o acetil-CoA sintetază (ACD) care formează ADP (acetil-CoA + ADP + Pi⇆ acetat + ATP + CoA). Această sintetază neobișnuită a fost găsită în toate archaea formatoare de acetat, inclusiv în hipertermofilele anaerobe, și reprezintă un mecanism nou la procariote de formare a acetatului și de sinteză a ATP. În archaea hipertermofilă anaerobă, de exemplu Pyrococcus furiosus, ACD reprezintă principala reacție de conservare a energiei în timpul metabolismului zaharurilor, piruvatului și al peptidelor. Spre deosebire de mecanismul arheal cu o singură enzimă, toate bacteriile utilizează mecanismul „clasic” cu două enzime pentru conversia acetil-CoA în acetat, implicând fosfat acetiltransferaza (PTA) și acetat kinaza (AK) .

S-a raportat că mai multe haloarheea, inclusiv H. marismortui, Haloferax volcanii și Halorubrum saccharovorum, cresc pe acetat ca substrat. Metabolismul acetatului este inițiat prin activarea acestuia în acetil-CoA. Recent, am furnizat primele dovezi că activarea acetatului în acetil-CoA în haloarchaea este catalizată de o acetil-CoA sintetază (ACS) formatoare de AMP (acetat + ATP + CoA → acetil-CoA + AMP + PPi). ACS este principala enzimă de activare a acetatului pentru majoritatea organismelor utilizatoare de acetat din toate cele trei domenii ale vieții . Doar câteva bacterii, de exemplu Corynebacterium glutamicum, precum și arheonul metanogen acetoclastic Methanosarcina ssp. activează acetatul în acetil-CoA prin intermediul cuplului AK/PTA . Astfel, calea AK/PTA poate funcționa în mod reversibil in vivo, adică atât în direcția formării de acetat, cât și în direcția activării acetatului. În schimb, primele analize sugerează că în haloarchaea ACD, omologul arheal al cuplului AK/PTA, funcționează in vivo în direcția formării de acetat, deși enzima catalizează o reacție reversibilă in vitro.

Pentru a elucida în continuare rolul fiziologic și pentru a obține primele informații despre reglarea dependentă de substrat a enzimelor de conversie a acetatului și acetil-CoA în haloarchaea, am efectuat experimente de schimbare a substratului cu H. marismortui și am analizat creșterea pe glucoză, acetat, amestecuri de glucoză/acetat și peptide. În timpul creșterii au fost analizate profilurile de activitate ale enzimelor de conversie a acetatului și acetil-CoA, ACD și ACS, precum și ale glucozei dehidrogenazei, prima enzimă în degradarea glucozei prin intermediul căii ED modificate. În plus, au fost determinate activitățile malat-sintetazei, o enzimă cheie a ciclului glioxilatului, propusă a fi operațională în haloarchaea.

2 Materiale și metode

2.1 Creșterea H. marismortui pe glucoză, acetat, amestecuri de glucoză/acetat și pe peptide

Haloarcula marismortui a fost cultivată aerob la 37 °C pe un mediu complex care conține extract de drojdie, casaminoacizi și, în plus, glucoză și/sau acetat, așa cum a fost descris anterior . Pentru creșterea pe amestec de glucoză/acetat, acest mediu a fost suplimentat cu 12,5 mM glucoză și 30 mM acetat. Creșterea pe peptide a fost realizată pe mediul complex în absența acetatului și a glucozei. Experimentele de creștere au fost efectuate în fermentoare de 2 l (fairmen tec, Germania) cu o viteză a agitatorului de 500 rpm și un debit de aer comprimat de 600 ml pe minut. Creșterea a fost urmărită prin măsurarea densității optice la 578 nm (ΔOD578). Un ΔOD578 de 1 a corespuns unui conținut de proteine de 0,5-0,6 mg/ml. Glucoza și acetatul au fost determinate enzimatic, așa cum este descris în .

2.2 Prepararea extractelor celulare

În diferite faze de creștere, celulele de H. marismortui (100-200 ml din cultură) au fost recoltate și extractele celulare au fost preparate așa cum este descris în . Proteinele au fost determinate prin metoda Bradford folosind seroalbumina bovină ca etalon.

2.3 Determinarea activităților enzimatice

Toate testele enzimatice au fost efectuate în condiții aerobe la 37 °C în cuve umplute cu 1 ml de amestec de testare. Enzimele auxiliare au fost adăugate, în general, cu puțin timp înainte de începerea reacției și s-a asigurat că aceste enzime nu sunt limitatoare de viteză. O unitate (1 U) de activitate enzimatică este definită ca 1 μmol de substrat consumat sau de produs format pe minut.

• Acetil-CoA sintetaza (formatoare de ADP) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) a fost măsurată așa cum este descris în .

• Acetil-CoA sintetaza (formatoare de AMP) (ACS) (E.C. 6.2.1.13).C. 6.2.1.1.1.) a fost monitorizată ca eliberare de HSCoA dependentă de PPi și AMP din acetil-CoA în conformitate cu Srere și colab. cu reactivul tiol al lui Ellman, acidul 5′5-ditiobis (2-nitrobenzoic) (DTNB), prin măsurarea formării anionului tiofenolat la 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Amestecul de analiză a conținut 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetil-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi și extract.

• Malat-sintetaza (E.C. 4.1.3.2.) a fost monitorizată într-un test modificat conform Serrano et al. cu DTNB. Amestecul de testare a conținut 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetil-CoA, 0,5 mM glioxilat și extract.

• Glucoză dehidrogenază (E.C. 1.1.1.1.47) a fost măsurată conform lui Johnsen et al. .

• Acetat kinaza (E.C. 2.7.2.1.) a fost măsurată conform descrierii din .

• Fosfotransacetilinaza (E.C. 2.3.1.8.) a fost monitorizată ca eliberare de HSCoA dependentă de Pi din acetil-CoA cu DTNB . Amestecul de testare a conținut 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetil-CoA, 5 mM KH2PO4 și extract.

3 Rezultate

Pentru a investiga funcția fiziologică și reglarea enzimelor legate de metabolismul acetatului și al acetil-CoA, celule de H. marismortui crescute în prealabil pe diferite substraturi au fost mutate în medii care conțin acetat și/sau glucoză și, respectiv, peptide, și au fost analizate profilurile de activitate ale ACD, ACS, GDH și MS.

3.1 Creșterea celulelor adaptate la acetat pe glucoză

După o fază de decalaj, celulele au crescut exponențial și glucoza a fost complet consumată. În paralel cu consumul de glucoză s-au format cantități semnificative de acetat. În această perioadă, activitățile GDH și ACD au crescut, în timp ce activitățile ACS și MS, care erau active în celulele adaptate la acetat, au fost complet reduse. În faza staționară, acetatul excretat a fost complet reconsumat și atât activitățile ACS cât și MS au crescut, în timp ce activitățile GDH și ACD au scăzut (Fig. 1).

3.2 Creșterea celulelor adaptate la glucoză pe acetat

Celele adaptate la glucoză au crescut inițial (aproximativ 30 h) pe un mediu care conține acetat, cu un timp de dublare de 10 h, până la o densitate optică (ΔOD578) de 1. În această fază de creștere nu s-a observat consum de acetat și celulele au crescut pe peptidele prezente în mediu. După această perioadă, celulele au crescut cu o rată de creștere redusă până la ΔOD578 de 1,8, iar acetatul a fost complet consumat. În timpul consumului de acetat, activitățile ACD și GDH au scăzut, în timp ce activitățile ACS și MS, care nu au putut fi detectate în celulele adaptate la glucoză, au crescut. Creșterea activității MS a început în timpul creșterii pe peptide, în timp ce creșterea activității ACS a fost paralelă cu consumul de acetat (Fig. 2).

3.3 Creșterea pe amestecuri de glucoză/acetat

Celele de H. marismortui adaptate la extract de drojdie și casaminoacizi au fost transferate în mediu care conține atât glucoză, cât și acetat. Celulele au prezentat o creștere diauxică cu utilizarea secvențială a primei glucoze și a celui de-al doilea acetat. În prima fază de creștere, celulele au crescut până la ΔOD578 de 4,0, iar glucoza a fost consumată. După consumul de glucoză și o scurtă fază de întârziere, celulele au intrat în cea de-a doua fază de creștere, în care a fost metabolizat acetatul și celulele au crescut până la un ΔOD578 final de 5,2. În prima fază de creștere paralelă cu consumul de glucoză, activitățile ACD și GDH au crescut, în timp ce activitatea ACS nu a putut fi detectată, iar activitatea MS a fost complet dereglementată. În a doua fază de creștere paralelă cu utilizarea acetatului, activitățile ACS și MS au crescut, iar activitățile ACD și GDH au scăzut (Fig. 3).

3.4 Celule adaptate la glucoză pe peptide

Celele adaptate la glucoză au fost mutate pe un mediu care conține 0,25% extract de drojdie și 0,5% casaminoacizi în absența atât a glucozei, cât și a acetatului. Celulele au crescut cu un timp de dublare de 13 h până la ΔOD578 de 2,5. Formarea de acetat nu a putut fi detectată. În timpul creșterii exponențiale, ACD (de la 60 la 20 mU/mg) și GDH (de la 80 la 40 mU/mg) au scăzut, iar activitatea MS, care inițial nu a putut fi detectată, a crescut până la 20 mU/mg. Activitatea ACS nu a putut fi detectată în timpul fazei de creștere exponențială, dar a crescut în timpul fazei staționare (13 mU/mg).

4 Discuții

În această lucrare am analizat rolul fiziologic al enzimelor de conversie a acetatului și acetil-CoA (ACD, ACS) la H. marismortui și oferim primele dovezi pentru reglarea specifică substratului acestor enzime, precum și pentru GDH și MS. Datele sunt discutate în comparație cu sistemele bacteriene cunoscute.

4.1 Formarea acetatului la H. marismortui este catalizată de ACD ca parte a metabolismului de „revărsare”

În timpul creșterii pe glucoză și pe amestecuri de glucoză/acetat, atât activitățile ACD cât și GDH au crescut în paralel cu fazele de consum de glucoză și formare de acetat (figurile 1 și 3). În schimb, ambele activități au scăzut în timpul creșterii pe acetat sau peptide. Aceste date și absența AK/PTA indică faptul că formarea de acetat în Haloarcula este catalizată de ACD. Rolul fiziologic al formării de acetat în H. marismortui și reglarea sa în timpul creșterii aerobe pe glucoză nu este înțeles; formarea de acetat ar putea face parte dintr-un metabolism de „revărsare”, care a fost studiat în detaliu la diverse bacterii, de exemplu Escherichia coli și Bacillus subtilis. La fel ca la H. marismortui, ambele bacterii excretă acetat în timpul creșterii aerobe cu exces de glucoză și îl reutilizează în faza staționară. S-a speculat că excreția de acetat are loc în condițiile în care rata glicolizei o depășește pe cea a căilor ulterioare, de exemplu, ciclul acidului citric și respirația necesară pentru oxidarea completă a glucozei . În aceste condiții, acetil-CoA este transformat în acetat și excretat. În conformitate cu acest punct de vedere, analizele transcripționale efectuate atât la E. coli, cât și la B. subtilis indică o inducție specifică glucozei a genelor glicolitice și o reprimare a genelor ciclului acidului citric și ale respirației . Pentru arheonul halofilic H. volcanii a fost recent raportată o reglare transcripțională specifică glucozei similară, adică o creștere a genelor glicolitice ale căii modificate Entner-Doudoroff și o reducere a unor gene ale ciclului acidului citric și ale respirației. Prin urmare, la haloarchaea este probabil să existe un metabolism de revărsare specific glucozei care duce la formarea de acetat. Formarea acetatului la E. coli și B. subtilis implică mecanismul bacterian cu două enzime prin PTA și AK, în timp ce la Haloarcula formarea acetatului este catalizată de ACD, mecanismul arheal cu o singură enzimă. Atât la E. coli, cât și la B. subtilis, s-a constatat că glucoza induce codificarea genelor pta și ack, ceea ce indică o reglare coordonată a glicolizei și a formării de acetat. Până în prezent, reglementarea transcripțională a ACD de formare a acetatului în arheonul H. marismortui nu a fost analizată. Cu toate acestea, reglarea coordonată a GDH și a activității ACD sugerează o reglare transcripțională similară, specifică glucozei, atât a glicolizei prin calea Entner-Doudoroff modificată, cât și a formării de acetat de către ACD.

În timpul creșterii aerobe pe peptide, H. marismortui nu a format acetat, iar activitatea ACD a fost reglată în jos. În această privință, Haloarcula diferă de bacteria E. coli, care formează cantități semnificative de acetat în timpul creșterii aerobe pe peptide în cursul unui metabolism de „revărsare”. H. marismortui diferă, de asemenea, de arheonul hipertermofilic anaerob P. furiosus și de alte archaea hipertermofile anaerobe, care formează cantități mari de acetat prin intermediul ACD în timpul creșterii anaerobe atât pe zaharuri, cât și pe peptide. În timpul fermentației anaerobe a peptidelor și a zaharurilor de către P. furiosus, formarea de acetat prin ACD reprezintă principalul loc de formare de ATP prin fosforilarea la nivelul substratului; în schimb, în timpul degradării aerobe a zaharurilor și a peptidelor de către H. marismortui, cea mai mare parte a energiei este conservată prin fosforilarea transportului de electroni în lanțul respirator și, prin urmare, formarea de acetat prin ACD este mai puțin importantă sau dispensabilă. Astfel, formarea de acetat de către ACD la Haloarcula pare să fie limitată la metabolismul zaharurilor în cursul unui metabolism „de depășire”.

4.2. Activarea acetatului în acetil-CoA la H. marismortui este catalizată de ACS

Aceasta a fost concluzionată din creșterea activității ACS în paralel cu consumul de acetat (Fig. 1, 2, 3). Un rol al ACD în activarea acetatului a putut fi exclus, deoarece ACD a fost reglată în jos în timpul perioadelor de consum de acetat. Astfel, ACD în Haloarcula funcționează in vivo numai în direcția formării de acetat. ACS este, de asemenea, cel mai frecvent mecanism de activare a acetatului la bacterii, unde este strict reglementat; de exemplu, la E. coli și B. subtilis, gena acs este indusă de acetat și reprimată de glucoză . La Haloarcula, reglarea în sus a activității ACS de către acetat și reglarea în jos de către glucoză sugerează o reglementare similară la nivel transcripțional cu cea raportată pentru bacterii. Trebuie remarcat faptul că, spre deosebire de E. coli și B. subtilis, bacteria C. glutamicum activează acetatul printr-o cale AK/PTA indusă de acetat.

Activitatea MS, o enzimă cheie a ciclului glioxilatului, a fost crescută în timpul perioadelor de consum de acetat la H. marismortui împreună cu ACS, sugerând o reglare coordonată specifică acetatului a ACS și a ciclului anaplerotic al glioxilatului. Atât MS, cât și activitatea ACS au fost reduse de glucoză. Inducția coordonată, specifică acetatului, a genelor enzimelor de activare a acetatului (a se vedea mai sus) și a căii glioxilatului a fost raportată pentru mai multe bacterii, inclusiv E. coli și C. glutamicum. Recent, prima dovadă a inducerii atât a genei malat-sintetazei, cât și a genei izocitrat-lizazei de către acetat a fost furnizată pentru arheonul halofilic H. volcanii.

Cu toate acestea, activitatea MS, mai degrabă decât activitatea ACS, a fost, de asemenea, crescută în timpul creșterii exponențiale pe peptide în absența acetatului, ceea ce indică faptul că reglarea MS este mai complexă și nu se limitează la acetat. Un rol al MS (și al ciclului glioxilatului) în metabolismul peptidelor ar putea fi explicat prin faptul că mulți aminoacizi sunt degradați în acetil-CoA, ceea ce ar necesita o cale funcțională a glioxilatului pentru anabolism. Creșterea activității ACS, observată în faza staționară în timpul creșterii pe peptidelor, nu poate fi explicată până în prezent, aceasta ar putea fi datorată unui răspuns general la stres al celulelor în fază staționară .

4.3 Represiunea catabolită specifică glucozei la H. marismortui

Haloarcula marismortui a prezentat o creștere diauxică pe amestecuri de glucoză/acetat, glucoza fiind substratul preferat, indicând un fel de represiune catabolică a utilizării acetatului de către glucoză. Represiunea catabolită specifică glucozei nu a fost analizată până în prezent la archaea. La bacterii, baza moleculară a reprimării catabolitei carbonului de către glucoză a fost studiată în detaliu, de exemplu la E. coli și B. subtilis. În timpul creșterii lui C. glutamicum pe amestecuri de glucoză/acetat a fost descrisă o creștere monofazică cu consum simultan de acetat și glucoză, în timp ce la Azotobacter vinelandii acetatul este substratul preferat. Principiile de reglare care stau la baza acestor caracteristici sunt în prezent investigate .

Sunt necesare studii suplimentare pentru a fundamenta reglarea propusă a reglementării specifice substratului a enzimelor de formare a acetatului și de activare a acetatului, ACD și ACS, în legătură cu metabolismul acetatului și al glucozei la nivel transcripțional. Aceste studii, care necesită purificarea și identificarea genelor codificatoare ale ACD și ACS din H. marismortui, sunt în curs de desfășurare.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

Note ale autorului

.