Sinteza și activitatea de inhibare a unor derivați de 4-hidroxicumarină asupra proteazei HIV-1

Abstract

Șase noi derivați de 4-hidroxicumarină au fost sintetizați în mod rațional, verificați și caracterizați prin docking molecular folosind cristale de protează HIV-1. Studiile de docking molecular au prezis activitatea antiproteazică a (7) și (10). Cele mai importante grupe funcționale, responsabile de interacțiunea cu proteinaza HIV-1 prin formarea de legături de hidrogen, sunt oxigenul, atomul de piran, oxigenul carbonil al lactonei și una dintre grupele hidroxil. Compușii nou sintetizați au fost testați biologic în celulele MT-4 pentru inhibarea replicării HIV-1, explorând protecția celulelor împotriva efectului citopatic al HIV măsurat prin supraviețuirea celulară în testul MTT. Un derivat -7 a prezentat o inhibiție de 76-78% a infectivității virusului cu IC50 = 0,01 nM, mult mai mică decât concentrația maximă netoxică (1 mM). Activitatea antiproteazei 7 în două concentrații diferite a fost detectată ca fiind de 25%. Cu toate acestea, rezultatele studiului lui (7) încurajează utilizarea acestuia ca farmacofor pentru sinteza și evaluarea ulterioară a activității anti-HIV.

1. Introducere

Proteaza retrovirală (PR) a virusului imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1) este una dintre enzimele cheie pentru replicarea virusului. Aceasta scindează precursorii de proteine și glicoproteine pentru a produce enzime virale active și proteine structurale. PR-ul inactiv al HIV-1 conduce la virioni neinfecțioși. Acest fapt a stimulat căutarea unor substanțe puternice cu activitate antiproteazică care să inhibe replicarea HIV-1. În ultimii 12 ani, un număr de analogi peptidomimetici – inhibitori ai PR HIV-1 (IP) – au fost introduși clinic, dar cea mai mare parte dintre aceștia prezintă caracteristici farmacologice slabe, cum ar fi o biodisponibilitate orală proastă, o eliminare rapidă și probleme de tolerabilitate – adesea asociate cu lipodistrofia și dislipidemia . De asemenea, din cauza faptului că sunt peptidomimetice, izolatele virale demonstrează rapid un grad ridicat de rezistență și rezistență încrucișată chiar și atunci când se utilizează membrii grupului înainte ca IP-urile să fie introduse pe piață .

Dezvoltarea de noi IP-uri nepeptidice, cum ar fi Tipranavir și Darunavir, a arătat o potență impresionantă împotriva mutanților rezistenți la IP-uri, rămânând astfel o opțiune importantă pentru pacienții care adăpostesc o astfel de rezistență . Acesta este motivul pentru a căuta noi substanțe non-peptidice-inhibitori ai proteazei HIV-1. Datele experimentale privind unele substanțe nepeptidice – 4-hidroxicumarine (figura 1) și derivați de 4-hidroxipiran care inhibă PR HIV-1 – susțin această idee .

Figura 1

Structura 4-hidroxicoumarinelor.

fiind de mulți ani interesați de sinteza și evaluarea unei serii de substanțe nepeptidice, cum ar fi derivații de 4-hidroxicumarină , am fost încurajați să extindem aceste experimente. Aici, sunt prezentate o serie de sinteze noi, însoțite de experimente de docking molecular folosind enzima cristalină și evaluarea activității biologice a unor noi și promițători derivați de 4-hidroxicoumarin.

2. Rezultate și discuții

2.1. Rezultate și discuții. Sinteza derivaților de 4-hidroxicumarină

2.1.1. Sinteza arilmetilen-β-cetoesterilor

Aldehidele aromatice diferit substituite sunt utilizate pentru sinteza arilmetilen-β-cetoesterilor prin reacția Knoevenagel cu acetoacetat de etil în prezența piperidinei ca agent bazic și a acidului acetic glacial. Acești arilmetilen-β-cetoesteri pot fi prezentați ca în figura 2.

Figura 2

Structura chimică generală și sinteza arilmetilen-β-cetoesterilor.

O reacție de 4-hidroxibenzaldehidă și 2,4-pentanedionă a fost, de asemenea, realizată în aceleași condiții ca cele menționate mai sus. Produsul izolat a fost 3-(4-hidroxi)fenilmetilen-2,4-pentanedionă (6) , a se vedea figura 3.

Figura 3

Sinteza 3-(4-hidroxi)fenilmetilen-2,4-pentanedionei (6).

2.1.2. Adiția Michael a arilmetilen-β-cetoesterilor și a arilmetilen-2,4-pentanedionelor cu 4-hidroxicumarina

A doua etapă a reacției este o adiție a arilmetilen-β-cetoesterilor obținuți cu 4-hidroxicumarina prin reacția Michael, folosind metoxidul de sodiu sau piperidina ca agent bazic . Această reacție poate fi exprimată ca în figura 4.

Figura 4

Adația Michael a 4-hidroxicumarinei și a arilmetilen-β-cetoesteri.

Figura 5

Adația Michael a 4-hidroxicumarinei și a 3-(4-hidroxi)fenilmetilen-2,4-pentanedionei (6).

2.2. Docking molecular

A fost investigată interacțiunea proteazei HIV-1 prin docking molecular cu câțiva noi derivați de 4-hidroxicumarină sintetizați. Datele experimentale pentru activitatea unor 4-hidroxicumarine au fost folosite pentru comparație.

Abordarea moleculară preliminară a fost realizată pe baza derivaților cunoscuți de 4-hidroxicumarină, care au activitate de inhibare a proteazei HIV-1 (tabelul 1) . Grila este aleasă pentru a supradimensiona ligandul care este legat anterior de enzimă (în acest caz a fost aleasă dimensiunea de 7 Å a grilei).

Valorile funcțiilor 𝐺-score și E-model au fost obținute prin această metodă. Ele se numesc funcții de scor și sunt echivalente abstracte ale Δ𝐺bind. Aceste funcții iau în considerare energia liberă datorată efectelor solventului, modificărilor conformaționale ale proteinei și ligandului, interacțiunilor dintre proteină și ligand (legături de hidrogen, interacțiune ionică și forțe van der Waals), pierderea de energie liberă de înghețare a rotației interne a proteinei și ligandului, pierderea de energie liberă în energia de translație și rotație, cauzată de asocierea celor două molecule, și energia liberă datorată modificărilor modului vibrațional (de obicei ignorată). În cazul în care aceste valori sunt mai negative pentru un ligand, aceasta înseamnă că capacitatea de legare a acestui ligand este mai bună. Atunci când ligandul prezintă o capacitate de legare într-o conformație determinată, programul o arată ca fiind o „poziție bună”.

Această enzimă este formată din două lanțuri polipeptidice și face parte din familia aspartil proteazelor cu două resturi de aspartat situate în partea inferioară a situsului activ. Am folosit structura cristalografică a proteazei retrovirale HIV-1, legată cu un inhibitor peptidomimetic BEA369 din Protein Data Bank cu codul pdb 1EBY.

Se poate concluziona că ligandul (1) are cea mai puternică capacitate de legare la proteaza HIV-1. Rezultatele docking-ului molecular confirmă datele experimentale cu privire la ligandul (1).

În ceea ce privește liganzii (1)-(5), valorile 𝐺-score și E-model din docking-ul molecular, pentru grupul de compuși testați, sunt prezentate în tabelul 2.

Interacțiunile dintre derivații de 4-hidroxicumarină investigați și situsurile active ale enzimei HIV-1 protează sunt realizate prin legături de hidrogen și interacțiuni van der Waals. Cel mai activ compus, de exemplu, cu cea mai bună activitate de legare, este compusul (10), conform liganzilor (1)-(4) (pe baza valorilor funcțiilor de scor). Acest fapt se datorează probabil unei formări de legături de hidrogen între atomul de oxigen al piranului, oxigenul carbonil al lactonei și una dintre grupele hidroxil (în metapoziție) atașate inelului aromatic din lanțul lateral. Forțele de atracție van der Waals contribuie, de asemenea, la o bună legare. În funcție de ligandul (5), cel mai activ este compusul (7). Există două legături de hidrogen pentru compusul (7) cu participarea atomului de oxigen al piranului, a atomului de oxigen al carbonilului din inelul lactonei și a unuia și a fragmentelor proteice corespunzătoare. Interacțiunile de atracție van der Waals, în care participă probabil grupul m-nitro cu unul dintre atomii de oxigen ai acestuia, sunt substanțiale pentru legare. Compusul (7) pare a fi mai activ decât liganzii experimentali.

2.3. Activitate biologică în cultura celulară (celule MT-4)

După ce s-a demonstrat activitatea unor derivați de 4-hidroxicumarină față de HIV-PR izolat în experimentele de andocare moleculară, ar fi de interes să îi testăm în continuare pe celulele MT-4 infectate cu HIV-1. Evaluarea efectului anti-HIV a fost realizată printr-un test de infecție in vitro, rapid și sensibil, în microtitrare, bazat pe cuantificarea citolizei prin absorbția colorantului vital (MTT) ca punct final al infecției. În plus, efectul inhibitorilor asupra activității endogene de transcriptază inversă (RT) a supernatantelor MT-4 infectate cu HIV-1 III B a fost considerat ca un marker pentru capacitatea de blocare a replicării HIV-1. Celulele MT-4 au fost infectate și incubate cu fiecare inhibitor timp de 72-96 de ore, iar apoi activitatea RT a fost măsurată în supranaturile celulare în conformitate cu orientările din testul HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suedia). S-a efectuat, de asemenea, un studiu al efectului direct al 4-hidroxicumarinelor nou sintetizate asupra RT recombinante exogene (rRT). În plus, toți compușii au fost testați pentru activitatea anti-HIV-1 PR. Tabelul 3 reprezintă rezultatele testului de infecție în microtitrare folosind MTT și inhibarea activității HIV-1 PR. Experimentele au fost efectuate în concentrația maximă netoxică (MNC) pentru fiecare compus.

În primul rând, se observă că compușii (8), (7) și (12) au o MNC mai mare, ceea ce înseamnă că sunt mai citotoxici decât ceilalți trei compuși. Doar doi dintre ei (10) și (7) au inhibat replicarea virală în celulele MT-4, inhibiția indusă de (7) fiind remarcabilă (78%). Utilizând diluții virale de 10x, s-a stabilit că IC50 este de 0,01 nM. Niciun compus nu a avut efect atât asupra RT endogenă, cât și asupra RT exogenă. Acest lucru înseamnă că RT nu a fost ținta acțiunii antivirale. Așa cum s-a prezis prin studiile de andocare moleculară, activitatea HIV-1 PR a fost inhibată cu 24-25% au fost de (7) (s-au făcut 5 evaluări separate). Discordanța constatată pentru (7) între datele referitoare la inhibarea infectivității (aproximativ 75%) și activitatea proteazică (25%) ar putea fi explicată de o altă activitate, cum ar fi cea anti-integrazică. Este bine cunoscut faptul că unii derivați de 4-hidroxicumarină sunt inhibitori ai integrazei.

Experimentele descrise în această lucrare le extind pe cele raportate anterior, conform cărora derivații de 4-hidroxicumarină ar putea servi ca noi IP nepeptidici. În mod similar cu tipranavirul și darunavirul, aceștia ar putea fi eficienți la pacienții cu rezistență dezvoltată la IP peptidici. În special, (7) ar putea fi utilizat în continuare ca farmacofor pentru a sintetiza noi derivați mai activi față de proteaza HIV-1.

3. Concluzii

Sase compuși 4-hidroxicumarinici au fost sintetizați prin sinteză în două etape. Prima etapă este reprezentată de reacția Knoevenagel între aldehidele aromatice și acetoacetatul de etil sau acetilacetona. A doua etapă este adiția Michael a arilmetilen-β-cetoesterului sau a arilmetilen-2,4-pentanedionei obținute cu 4-hidroxicumarina. Produsele sunt identificate și caracterizate prin 1H RMN, EI-MS, FTIR și analiză elementară.

Studiul activității lor de legare la HIV-1 PR a fost realizat prin docking molecular. S-a folosit cristalul HIV-1 PR, legat cu inhibitorul peptidomimetic BEA369. Cea mai mare activitate de legare o prezintă compusul (10), în funcție de liganzii experimentali (1), (2), (3) și (4) și compusul (7), în funcție de ligandul 5. Acest fapt se datorează probabil formării unor legături de hidrogen între atomul de oxigen al piranului, oxigenul carbonil al lactonei și una dintre grupele hidroxil (în metapoziție) atașată inelului aromatic din lanțul lateral. Forțele de atracție van der Waals contribuie, de asemenea, la o bună legare.

Toți cei șase compuși au fost testați pentru activitatea anti-HIV-1 PR în celulele MT4 infectate cu HIV-1. Supraviețuirea celulară a fost evaluată prin testul MTT și, de asemenea, a fost măsurat procentul de inhibare a HIV-1 PR. Cea mai mare inhibiție a HIV-1 PR (25%) și cea mai mare supraviețuire a celulelor MT4 (78%) au fost demonstrate de compusul (7). Compusul (7) ar putea fi utilizat în continuare ca un farmacofor pentru a sintetiza noi derivați mai activi față de HIV-1 PR.

4. Partea experimentală

4.1. Sinteza derivaților de 4-hidroxicumarină

4.1.1. Materiale și metode

Toate materialele de pornire au fost achiziționate de la Merck, Sigma-Aldrich și Fluka. Acestea sunt utilizate fără purificare suplimentară. Punctele de topire sunt măsurate în tuburi capilare deschise pe un aparat Büchi 535 pentru punct de topire. Spectrele IR au fost înregistrate la spectrometrul Shimadzu FT-IR 8101 M în nujol, iar frecvențele sunt exprimate în cm-1. Spectrele 1H RMN au fost înregistrate la Brucker 250 MHz în DMSO-d6 sau acetonă folosind TMS ca standard intern (deplasările chimice sunt raportate în unități ppm, constantele de cuplaj (𝐽) în Hz). Abrevierile sunt după cum urmează: s: singlet, d: dublet, dd: dublu dublet, dq: dublu cvartet, dqui: dublu cvintet, t: triplet și m: multiplet.

Analiza spectrală de masă a fost efectuată prin ionizare electronică pe spectrometrul de masă Hewlett-Packard 5973 la 70 eV.

4.1.2. Procedură generală pentru prepararea arilmetilen-β-cetoesterilor

Adehida aromatică și etilacetoacetatul în cantități echimolare se amestecă într-un balon cu fundul rotund. În amestecul de reacție se adaugă, de asemenea, piperidină (0,03 mol) și acid acetic glacial (0,04 mol). Acesta din urmă se agită la temperatura camerei timp de 90 de minute. După ce se adaugă 20 ml de eter și/sau 150 ml de apă distilată la amestecul de reacție, se formează cristale cu culori diferite. Aceste cristale se filtrează și se spală. Apoi, se usucă la temperatura camerei și se recristalizează în solvenți corespunzători – în principal alcooli (etanol, propanol și 2-propanol) și apă.

4.1.3. Procedură pentru prepararea 3-(4-hidroxi)-fenilmetilen-2,4-pentandionei (6)

4-hidroxibenzaldehida (3,66 g, 0,03 mol) și acetilacetona (5,14 ml, 0,05 mol) se amestecă într-un balon cu fund rotund. În amestecul de reacție se adaugă, de asemenea, piperidină (0,03 mol) și acid acetic glacial (0,04 mol). Acesta din urmă se agită la temperatura camerei timp de 120 de minute. După aceea, se adaugă 150 ml de apă distilată la amestecul de reacție. Se formează cristale cu culori diferite. Aceste cristale se filtrează și se spală. Apoi se usucă la temperatura camerei și se recristalizează în clorură de metilen.

4.1.4. Procedură generală pentru prepararea produselor de condensare cu 4-hidroxicumarina

Arylydene-β-cetoesterul, obținut în reacția anterioară, și 4-hidroxicumarina se amestecă în cantități echimolare în 25-30 mL de metanol (folosit ca solvent). La reactivi se adaugă, de asemenea, metoxid de sodiu (0,003 mol) ca agent bazic. Amestecul de reacție se fierbe și se agită timp de 60 de ore la reflux. Reacția este controlată prin TLC (hexan : acetonă = 2 : 1 sau hexan : acetonă : cloroform : metanol = 5 : 3 : 2 : 1). Când cantitățile de reactivi se epuizează, s-a oprit încălzirea. Reziduul din amestecul de reacție a fost filtrat și spălat cu apă caldă, pentru a se elimina 4-hidroxicoumarina care nu a reacționat. După aceea, reziduul se usucă la temperatura camerei și se recristalizează în solventul corespunzător (metanol, etanol sau 2-propanol).

4.1.5. Adiția Michael între 3-(4-hidroxibenziliden)-2,4-pentanedionă (SS-23) și 4-hidroxicoumari

3-(4-hidroxibenziliden)-2,4-pentanedionă (1,02 g, 0,005 mol) și 4-hidroxicoumarina (0,81 g, 0,005 mol) se amestecă într-un ușor exces de 4-hidroxicoumarina în 15-25 ml de metanol. La reactivi se adaugă, de asemenea, piperidină (0,003 mol) ca agent bazic. Amestecul de reacție se fierbe și se agită timp de 60 de ore la reflux. Reacția este controlată prin TLC (hexan : cloroform : acid acetic = 10 : 10 : 4, hexan : cloroform : acid acetic = 10 : 10 : 2, hexan : acetonă = 2 : 1). Când cantitățile de reactivi s-au epuizat, s-a oprit încălzirea. Reziduul din amestecul de reacție a fost filtrat și a fost spălat cu apă caldă, pentru a elimina 4-hidroxicoumarina care nu a reacționat. După aceea, reziduul se usucă la temperatura camerei și se recristalizează în acetonă.

4.2. Docking molecular

Toate calculele de docking molecular sunt efectuate cu programele Maestro Macromodel Glide din pachetul Schrodinger . Toate structurile (testate experimental și cele noi) sunt minimizate cu programul Macromodel, utilizând câmpul de forță OPLS2005 și 5000 de iterații. Structura cu raze X a enzimei HIV-1 protează, împreună cu inhibitorul BEA369, este obținută din Protein Data Bank cu codul PDB 1EBY.

4.3. Liniile celulare și virușii

Linia celulară de suspensie limfoblastoidă umană MT-4-a, pusă la dispoziție cu amabilitate de Gianfranco Pancino- Institutul Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paris, Franța) reprezintă un model clasic pentru infecția productivă experimentală cu tulpina HIV-1 III B și este utilizată ca țintă de rutină pentru studiul efectului inhibitorilor putativi ai HIV în cultura celulară .

Ca sursă de HIV-1, s-au folosit supernatantele liniei H9/HTLV III B – un cadou de la Dr. R. Gallo (NIH, SUA). Supernatantele au fost colectate și centrifugate pentru a elimina celulele, iar stocurile de virus au fost pregătite cu conținut cunoscut de antigen p24 (460 pg/mL, testul Murex HIV Antigen mAB), activitate RT (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Suedia) și infectivitate (2 × 106 virioni infecțioși/mL, testul de infecție în microtitrare) . Celulele MT-4 și H9/HTLV III B au fost cultivate în RPMI 1640 suplimentat cu 10% FCS (invitrogen).

4.4. Teste de citotoxicitate și teste antivirale în cultura celulară

Compușii studiați au fost mai întâi dizolvați în DMSO și apoi diluați în mediu de creștere celulară fără ser fetal. Toate soluțiile au fost preparate ex tempore.

S-au studiat următorii parametri: concentrația citotoxică 50-CC50, atunci când a fost posibil (concentrația care împiedică moartea a 50% din celulele MT-2), concentrația maximă netoxică-MNC și concentrația inhibitorie 50-IC50 (concentrația care inhibă cu 50% replicarea virală). CC50 și MNC au fost detectate prin testul de absorbție MTT . IC50 a fost studiată pe celulele MT-4 prin testul de infecție în microtitrare explorând protecția celulelor împotriva efectului citopatic al HIV măsurat prin testul MTT . Experimentele în condiții de infecție acută au fost efectuate în microplăci cu 96 de godeuri, cu 6-8 perechi/experiment. La fiecare experiment s-au efectuat controale celulare (celule MT-4 doar cu mediu) și controale virale (celule MT-4 infectate cu virus). Pentru testele antivirus, s-a adăugat HIV în fiecare gode pentru a obține o multiplicitate a infecției de 0,1, cu excepția controalelor celulare. Atașarea virusului a fost lăsată timp de o oră la 37°C/5% CO2. Plăcile au fost incubate timp de 72-96 de ore la 37°C/5% CO2. După aceea, testul MTT a fost efectuat conform descrierii și absorbția celulelor viabile a fost măsurată colorimetric la A540 nm. Pentru toate experimentele, s-a calculat valoarea medie a fiecărei coloane (numai dacă valorile la A540 nu diferă în proporție de ±10%). Pentru testele antivirale, s-au comparat valorile medii ale rândurilor experimentale și ale rândurilor de control, iar procentul de celule protejate (supraviețuire celulară) sub concentrația corespunzătoare a substanței a fost trasat în raport cu concentrația substanței pentru a obține IC50. Supraviețuirea celulară (% de protecție celulară) a fost calculată conform următoarei formule: =%protecție celularăA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControl-A540ControlHIV×100,(1) unde 𝑋 este valoarea medie a A540 a celulelor infectate cu HIV tratate cu concentrația corespunzătoare a compusului studiat; controlul HIV este valoarea medie a A540 a celulelor infectate cu HIV fără adăugarea vreunui compus; controlul celular este valoarea medie a A540 a celulelor neinfectate și netratate cu inhibitor.

Ca substanță de referință, au fost utilizate ABC (Abacavir binecunoscutul inhibitor nucleozidic al transcriptazei inverse-NRTI) și pepstatin.

4.4.1. Activitatea RT endogenă și efectul direct al compușilor asupra RT

A fost testată prin testul HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suedia). Kitul conține RT recombinant (rRT) ca standard, ceea ce face posibilă cuantificarea RT. Pentru testarea RT endogenă, supranaturile celulelor MT-4 infectate/neinfectate cu HIV-1 după incubarea cu/fără compuși au fost testate în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Nivelul de activitate RT în supranatant a fost calculat (în pg/mL) din standardul HIV-1 rRT stabilit în fiecare kit. Efectul direct al compușilor asupra activității rRT a fost măsurat cu aceeași trusă și a urmărit să demonstreze că RT este o țintă a acțiunii antivirale. Diluțiile treptate corespunzătoare ale inhibitorului au fost preparate în tampon de control și adăugate la amestecul de reacție. Reacția s-a desfășurat timp de 3 ore la 33°C. Activitatea RT a diluțiilor standard a fost comparată cu cea în care au fost adăugați compușii sau cu martorii (în care s-a adăugat doar amestecul de incubare fără compuși).

4.4.2. Detectarea activității antiproteazei prin teste care utilizează PR virală nativă

O metodă descrisă anterior de Broglia et al., 2006 , pentru detectarea activității proteazei recombinate a fost modificată pentru a utiliza protează virală nativă . Ca sursă de protează nativă HIV-1, s-a folosit din nou o suspensie de stoc viral concentrat (50x) din supranatantele celulelor H9/HTLV IIIB infectate cronic. Liza particulelor virale și eliberarea enzimei active (protează) a fost efectuată cu ajutorul unui tampon de dezintegrare (liză) care conține 2,5% Triton X-100 în tampon fosfat. Concentrarea lichidului de cultură tisulară care conține virusul s-a realizat prin ultracentrifugare în Biofuge Stratos, Heraeus, timp de 1 oră, la 4°C și 35000 rev/min. Peletul a fost resuspendat pentru a se obține un concentrat de 50x în tampon de dezagregare.

Pentru fiecare experiment s-a preparat următorul amestec de reacție: 1000 𝜇L tampon fosfat (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L substrat III de protează HIV (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Elveția) în DMSO, preparat ex tempore; 20 μL de enzimă (stoc HIV) luată dintr-o soluție care conține 25 𝜇L de tampon de dezorganizare (liză) + 100 μL de stoc HIV, incubată 40 min la 37°C înainte de experiment.

Activitatea HIV-1 PR a fost măsurată prin citire spectrofotometrică directă a utilizării substratului de reacție enzimatică la 300 nm, la temperatura camerei și la o lungime de parcurs de 1 cm, cu ajutorul spectrofotometrului T80 + UV-Vis (PG instruments). Viteza inițială de reacție (V0) a fost ajustată pentru a fi de 0,0020-0,0030 ΔAbs/min prin variația activității enzimatice (concentrația virală). Compusul testat și inhibitorul de referință (pepstatina utilizată în acest caz) au fost adăugate în amestecul de reacție înainte de enzimă, pentru a efectua screening-ul pentru efectul inhibitor. IC50 a fost definită ca fiind concentrația compusului testat care scade viteza de reacție cu 50% din viteza inițială fără compusul testat (de referință).