Acetilcolina este sintetizată din acetil coenzima A și colină de către enzima colină acetiltransferază. În sistemul nervos, se crede că această enzimă există în principal în citoplasma terminalelor nervoase. Coenzima A este sintetizată în mitocondrii și accesează colina acetiltransferaza în urma transportului prin membrana mitocondrială în citoplasmă. În plus față de sinteza sa în ficat, colina utilizată în producerea acetilcolinei provine din surse alimentare. Există un sistem de transport în celulele endoteliale capilare care este responsabil pentru transportul colinei, în formele sale libere și fosfolipidice, în creier. Hidroliza fosfolipidelor care conțin colină poate, de asemenea, să elibereze colina care este utilizată în sinteza acetilcolinei. Deoarece colină acetiltransferaza nu este saturată de concentrațiile de acetil coenzima A și colină care se estimează a fi prezente în terminalul nervos, se pare că rata de sinteză a acetilcolinei depinde de disponibilitatea precursorilor. Activitatea enzimatică este, de asemenea, reglată prin inhibarea produsului; prin legarea la un situs alosteric pe colină acetiltransferaza, acetilcolina îi inhibă activitatea. În plus, acțiunea de masă și activitatea neuronală influențează rata de formare a acetilcolinei. Reglarea pe termen scurt a activității enzimei se realizează parțial prin fosforilarea indusă de proteine kinazice. Nu există inhibitori foarte specifici și puternici ai enzimei și trebuie remarcat faptul că blocarea farmacologică a acestei etape (de exemplu, cu naftilvinilpiridină) în ciclul de viață al acetilcolinei produce un efect mai puțin profund asupra transmițătorului decât inhibarea transportului de colină.
Un transportor specific de acetilcolină de joasă afinitate este responsabil de absorbția transmițătorului din citoplasmă în vezicule. Genele pentru colină acetiltransferaza și transportatorul vezicular de acetilcolină sunt organizate într-un singur locus genetic, iar transcripția celor două gene este de obicei coreglementată. (±)-Vesamicolul este un inhibitor selectiv al acestui transportor, L-(-)-vesamicolul fiind mai puternic decât D-(+)-vesamicolul. Odată împachetată în vezicule, acetilcolina este supusă eliberării induse de stimuli prin exocitoză. Mai multe toxine puternice au un impact asupra eliberării de acetilcolină, în special toxina botulinică, care inhibă eliberarea acesteia.
Acetilcolinesteraza neuronală inactivează foarte rapid majoritatea acetilcolinei eliberate în creier, deși butirilcolinesteraza conținută în celulele gliale poate hidroliza o mică proporție de acetilcolină în sinapsă. La periferie, acetilcolinesteraza este prezentă în mușchii care primesc inervație colinergică, în timp ce butirilcolinesteraza este distribuită mai larg. Se cunosc o serie de inhibitori reversibili (de exemplu, fizostigmina, BW284C51) și ireversibili (de exemplu, izo-OMPA) ai acetilcolinesterazei, iar aceste medicamente au ca efect prelungirea efectelor sinaptice ale acetilcolinei. Anticolinesterazele reversibile de a doua generație, cum ar fi donepezilul, rivastigmina (ENA 713), eptastigmina și galantamina (galanthamina), sunt utilizate ca tratamente pentru boala Alzheimer. Unele colinesteraze din a doua generație au fost retrase din utilizarea clinică din cauza efectelor secundare inacceptabile (de exemplu, tacrina, metrifonatul). Inhibitorii ireversibili ai acetilcolinesterazei sunt utilizați ca insecticide și agenți de război chimic. Colina, care este eliberată din acetilcolină de către acetilcolinesterază, este preluată înapoi în terminalele colinergice de către un transportor cu afinitate ridicată și reutilizată în sinteza transmițătorului. Hemicholinium-3 inhibă puternic și reversibil transportul colinei, ceea ce duce la o scădere profundă a formării de acetilcolină. Spre deosebire de hemicholinium-3, A-4 (un analog bis 4-metilpiperidinic al HC-3), este activ în urma administrării periferice. Analogii de muștar de azot ai colinei sunt inhibitori ireversibili puternici ai captării colinei de înaltă afinitate.
.