Proceduri de expresie a proteinei, de purificare și de analiză a hAASS-SDH
Vector: pFB-LIC-Bse
Linia celulară: DH10Bac
Tags și adaosuri: N-terminal, etichetă de hexahistidină scindabilă de protează TEV
Construiți secvența proteică:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(secvența subliniată conține un vector codificat His-și situsul de clivaj al proteazei TEV*)
Celele recoltate au fost resuspendate în tampon de liză (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL pe 1 mL cocktail de inhibitori de protează fără EDTA).
Pelotul celular a fost dizolvat în aproximativ 200 mL de tampon de liză și rupt prin omogenizare prin 2 treceri la 12.000 psi. Resturile celulare au fost peletizate la 35000 x g, 1h, iar supernatantul a fost utilizat pentru purificare pe o coloană Ni-NTA cu flux gravitațional (5 mL).
Buferele utilizate sunt detaliate în continuare;
Buffer de legare: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Buffer de spălare: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 40 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Buffer de soluție de diluție: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 250 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Extractul celular clarificat a fost adăugat la 5 ml de rășină Ni-NTA preechilibrată cu tampon de liză și trecut printr-o coloană de sticlă. Coloana a fost apoi spălată cu Binding Buffer (2 x 50 ml) și Wash Buffer (2 x 50 ml). Proteina a fost eluată cu tampon de eluție în fracțiuni de 5 x 5 ml. Fracțiile eluate din coloana 1 au fost grupate și concentrate la 5 ml cu un concentrator de centrifugare de 30 kDa MWCO și injectate într-o coloană S200 16/60 (preechilibrată în GF Buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% glicerol)) la 1,0 ml/min. S-au colectat fracțiuni de 1,5 ml. Proteina eluată a fost scindată peste noapte la 4 °C cu protează TEV (1/20 (w/w)). A doua zi, proba de proteină a fost încărcată pe o coloană de Ni-sepharoză de 0,5 ml, preechilibrată cu tampon GF pentru a elimina proteina necoaglomerată. Fracțiunile proteice grupate au fost concentrate la 13 mg/mL cu ajutorul unui concentrator mwco de 30 kDa.
Dezvoltarea activității și screening-ul
Activitatea SDH a hAASS a fost măsurată prin urmărirea reducerii NAD+ la NADH, profitând de faptul că forma redusă de NADH este fluorescentă atunci când este excitată cu lumină de 340 nm. Am adoptat testul în format de 384 de godeuri, cu detecție cu ajutorul cititorului de fluorescență PheraStar (BMG Labtech) (excitare/emisie = 340/480 nm). Acest test a dat un răspuns liniar cu o concentrație de proteine de până la 150 nM. O reacție tipică constă în 100 nM de enzimă purificată, 0,2 mM de NAD+, 1,3 mM de zaharopină. Tamponul de reacție este format din 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. Bibliotecile de compuși (LOPAC (Sigma) și NIH Clinical Collections I&II) au fost analizate intern la o concentrație de compuși de 20 μM.
Fluorimetrie de scanare diferențială
DSF a fost realizată într-o placă cu 96 de godeuri folosind un aparat RT-PCR Mx3005p (Stratagene) cu filtre de excitație și emisie de 492 și, respectiv, 610 nm. Fiecare gode a constat din 2 µL de proteină în 2 µM de tampon DSF (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL de SYPRO ORANGE diluat de 1000 de ori în tampon DSF din stocul producătorului (Invitrogen) și (dacă este cazul) 2 µL de ligand la diferite concentrații. Intensitățile de fluorescență au fost măsurate de la 25 la 96°C cu o rată de rampă de 3°C/min.
Cristalizarea
Cristalele de apo au fost preparate prin amestecarea a 50 nL de proteină hAASS-SDH (80 mg/mL) cu 100 nL de soluție rezervor care conține 20% PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 și 0,2-0,33 M malonat de sodiu. Cristalele legate de NAD+ au fost preparate prin amestecarea a 100 nL de hAASS-SDH (18 mg/mL, în exces molar de NAD+) cu 50 nL de soluție rezervor care conține 25% PEG3350, 0,2M NaCl și 0,1M tris pH 8,5. Cristalele au fost crioprotejate în butanediol 9% înainte de congelare în azot lichid. Pentru campania de depistare a fragmentelor, cristalele au fost îmbibate cu compuși (10/50/500 mM) în soluția de cristalizare suplimentată cu 8% butanediol timp de 5-30 min, apoi au fost congelate în azot lichid.
Proceduri de determinare a structurii
Cristalele apo și NAD+-legate de hAASS-SDH aparțin unor grupuri spațiale diferite (P43212 vs P212121). Structura hAASS-SDH a fost rezolvată prin înlocuire moleculară cu programul PHASER, folosind ca model de căutare sacaropaza fungică din S.cerevisiae (cod PDB 2AXQ) (38% identitate de secvență). Au fost găsite două molecule în unitatea asimetrică (u.a.). Modelul inițial a fost reconstruit cu ajutorul phenix.autobuild. O moleculă de NAD+ legată în situsul activ a fost identificată prin metoda diferenței Fourier și plasată manual în densitatea de electroni folosind Coot. Pentru a finaliza modelul, au fost efectuate cicluri iterative de phenix.refine, inclusiv rafinarea TLS, urmate de construirea manuală a modelului pentru reziduurile lipsă cu ajutorul Coot. Nu s-au aplicat restricții NCS din cauza diferențelor de conformație în domeniul III (res 278-376) din cele două copii din a.u. Atomii de solvent au fost plasați în timpul ultimelor patru cicluri de rafinare folosind phenix.refine. Pentru campania de depistare a fragmentelor, liganzii au fost identificați prin DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) folosind hărți de densitate a diferențelor. Legătorii mai slabi cu ocupare scăzută au fost evaluați cu ajutorul PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), bazat pe modele statistice pentru a găsi densitatea ligandului prezent într-un anumit set de date care nu este prezent în majoritatea seturilor de date. Coordonatele și factorii de structură pentru toate seturile de date sunt depozitate în RCSB Protein Data Bank. Statisticile privind colectarea și rafinarea datelor sunt disponibile pe paginile PDB.
Reactivi disponibili în comerț
CRISPR/Cas9 knockout plasmide
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157
.