Structura acidului lizozomal uman α-glucozidază – un ghid pentru tratamentul bolii Pompe

Prezentare structurală

GAA este sintetizată ca o glicoproteină de 110 kDa, care este direcționată către lizozom prin intermediul receptorului mannoză-6-fosfat și suferă în compartimentul endosomal tardiv/lizozomal o serie de evenimente proteolitice și de procesare a N-glicanilor pentru a produce o formă activă matură compusă din patru peptide strâns asociate19,20. Deoarece cristalizarea formei comerciale Myozyme® precursoare a rhGAA (Q57-C952) nu a permis obținerea de cristale care să difracteze dincolo de ~7 Å, iar predictorii de dezordine proteică21 au indicat prezența unor regiuni peptidice dezordonate, am efectuat proteoliza in situ cu α-chimotripsină pentru a elimina buclele de suprafață flexibile presupuse care împiedică formarea de contacte cristaline productive. Tratamentul proteolitic a dus la obținerea unei polipeptide cu o masă cu ~5 kDa mai mică decât precursorul rhGAA (Fig. 2a), care a cristalizat cu ușurință. Acest lucru ne-a permis să colectăm datele de difracție care se extind până la 1,9 Å și să rezolvăm structura rhGAA prin înlocuire moleculară (tabelul 1). Forma digerată proteolitic a avut o activitate comparabilă cu cea a precursorului (2,34 ± 0,06 și 2,26 ± 0,16 U mg-1 pentru precursor și, respectiv, forma matură), ceea ce indică faptul că tratamentul cu α-chimotripsină nu a modificat funcționalitatea rhGAA.

Structura cristalină a rhGAA corespunde formei mature a GAA placentar uman și rhGAA20 (Fig. 2b), sugerând că tratamentul cu α-chimotripsină a permis eliminarea regiunilor labile pentru protează (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 și A782-R794) într-un mod comparabil cu maturizarea proteolitică care are loc in vivo. Arhitectura generală a rhGAA este similară cu cea a omologilor umani ai familiei GH311 de glicozid hidrolaze din familia GH311, enzimele intestinale maltază-glucoamilază (MGAM)22,23 și sucrase-isomaltază (SI)24 (Fig. 2c și Fig. 1 suplimentară). Un domeniu trefoil de tip P N-terminal este urmat de un domeniu β-sheet, cilindrul catalitic (β/α)8 purtând două inserții după β-strands β3 (inserția I) și β4 (inserția II) și domenii β-sheet proximal și distal la C-terminal. Forma precursoare a rhGAA conține ~14 kDa de carbohidrat și au fost prezise și caracterizate șapte situsuri de glicozilare20. Am observat structuri glicanice de diferite lungimi pentru cinci dintre ele în structura cristalină, în special la N140, N233, N390, N470 și N652 (Fig. 2c și Fig. suplimentară 2). Am detectat o diferență reziduală de densitate electronică la N882, insuficientă pentru a modela o structură glicanică, și nu am observat o diferență de densitate electronică în apropierea lui N925.

Site activ și legare de inhibitori

Pungă îngustă de legare a substratului de rhGAA este localizată în apropierea capetelor C-terminale ale ramurilor β ale domeniului catalitic (β/α)8 și este modelată de o buclă din domeniul β-sheet N-terminal și de ambele inserții I și II (Fig. 2c). Enzimele din familia GH31 realizează cataliza prin intermediul unui mecanism clasic de reacție de dublă deplasare Koshland cu păstrarea configurației anomerice a carbonului în produs. Din caracterizarea timpurie a situsului catalitic al GAA25 și prin omologie cu membrii disecați mecanic din familia GH3126,27, nucleofilul catalitic și acidul/baza pot fi atribuite la D518 și, respectiv, D616. Pentru a înțelege mai bine interacțiunea rhGAA cu chaperonul farmacologic documentat 1-deoxynojirimicină16,28 și derivatul său N-hidroxietil-deoxynojirimicină29 (DNJ și, respectiv, NHE-DNJ), am înmuiat cristale de rhGAA cu acești inhibitori de iminosugar direcționați către situsul activ și am obținut pentru ambii complecși date de difracție care se extind până la o rezoluție de 2,0 Å (tabelul 1). DNJ se leagă într-o conformație 4C1 în subsitul de legare a substratului -130 și este stabilizat prin legături de hidrogen cu lanțurile laterale ale lui D404, D518, R600, D616 și H674. Alte interacțiuni stabilizatoare sunt furnizate de contactele hidrofobe cu W376, I441, W516, M519, W613 și F649 (Fig. 3a, b). În afară de o înclinare de 20° în lanțul lateral al lui W376, nu apar modificări conformaționale majore la legarea DNJ în situsul activ al rhGAA. Acest lucru nu este valabil pentru legarea NHE-DNJ, care adoptă aceeași poziție ca DNJ, dar unde substituentul hidroxietil induce modificări conformaționale substanțiale ale lanțurilor laterale ale lui M519 și W481 (Fig. 3c, d). În această conformație indusă de ligand, reziduul W481 al rhGAA, situat pe vârful inserției I, stabilește o interacțiune stabilizatoare cu substituentul hidroxietil al NHE-DNJ. Modificări conformaționale similare pot fi observate la legarea NHE-DNJ la subunitatea N-terminală a MGAM (NtMGAM)31 (Fig. Suplimentară 3a).

Recunoașterea și specificitatea substratului

Pentru a culege o percepție a recunoașterii substratului de către rhGAA, am achiziționat datele de difracție extinse la o rezoluție de 2,45 Å pentru un cristal de rhGAA îmbibat cu acarboză, un analog de substrat α-1,4-tetrasacaridic necleavabil (tabelul 1). În acest complex, inelul de valienamină găzduit în subsitul -1 adoptă o conformație semicirculară 2H3, dar, în ciuda acestei diferențe conformaționale în raport cu DNJ legat în conformația semicirculară 4C1, modelul de legături de hidrogen în subsitul -1 este în esență identic pentru cei doi compuși (Fig. 3e, f și Fig. suplimentară 3b). Azotul „interglicozidic” nehidrolizabil ocupă centrul catalitic și este legat de hidrogen la acidul/baza catalitică D616. Fracțiunea 6-deoxiglucozil din subsitul + 1 stabilește, prin intermediul grupărilor sale 2 și 3-hidroxil, legături de hidrogen cu R600 conservat și cu D282 care provine dintr-o buclă din domeniul β-sheet N-terminal. Deși nu sunt conservate în secvență, reziduurile din această buclă interacționează invariabil cu liganzii glucidici în toate structurile cristaline disponibile ale membrilor familiei GH31. Unitatea de maltoză a acarbozei din subsitele + 2 și + 3 nu realizează nicio interacțiune directă cu rhGAA și este mai degrabă stabilizată de interacțiunile de împachetare a rețelei cristaline și de un contact mediat de apă cu lanțul lateral al W618, situat la marginea buzunarului de legare a substratului. Această sărăcie de interacțiuni sugerează că rhGAA posedă doar două situsuri productive de legare a substratului, subsituțiile -1 și + 1, dar, în mod interesant, fracțiunea acarboză-maltoză legată de rhGAA adoptă aceeași poziție generală ca atunci când este legată de NtMGAM22, sugerând un rol funcțional și pentru subsituțiile + 2 și + 3 în rhGAA (Fig. Suplimentară. 3c).

Glicogenul este un polimer de mari dimensiuni format din lanțuri liniare de reziduuri de glucoză legate de α-1,4 care poartă ramuri legate de α-1,6. În citosol, particula de stocare a energiei este degradată prin acțiunea concomitentă a glicogenului fosforilază și a unei enzime de debranșare. În cadrul lizozomului, nu este prezentă nicio enzimă de debranșare, iar GAA trebuie să asigure hidroliza atât a legăturilor α-1,4, cât și a celor α-1,6-glicozidice. Cu toate acestea, rhGAA arată o preferință clară pentru prima legătură, deoarece constanta de specificitate pentru maltoză este de 32 de ori mai mare în comparație cu constanta de specificitate pentru izomaltoză (tabelul suplimentar 2). Pentru a descoperi baza structurală a specificității duble a substratului, am încercat să îmbibăm cristalele de rhGAA cu tetrasacarida nehidrolizabilă glucopiranozil-α-(1,6)-thio-maltotrioză. Cu toate acestea, această abordare a eșuat, cel mai probabil din cauza contactelor cristaline care împiedică acomodarea tetrasacaridei, care, în virtutea legăturii α-1,6, este puțin mai lungă decât acarboza. S-a observat că aceasta din urmă abia se potrivește în fanta de legare a substratului și se sprijină strâns pe o moleculă înrudită din punct de vedere simetric (Fig. 3e). Am derivat o dizaharidă cu legătură α-1,6 legată în cadrul situsului activ al rhGAA printr-o suprapunere structurală a rhGAA cu domeniul catalitic (β/α)8 al GAA din Blautia obeum în complex cu izomaltoză32 (rmsd de 1,50 Å pentru 318 poziții Cα aliniate). Modelul arată că nu apare niciun impediment steric prin acomodarea unei legături α-1,6 între subsitul -1 și + 1 și că se mențin legăturile de hidrogen productive între fracțiunea glicopiranoză din subsitul + 1 și D282 (Fig. 4a, b). Cu toate acestea, din cauza lungimii crescute a legăturii α-1,6 în comparație cu o legătură α-1,4, legătura de hidrogen stabilizatoare cu R600 este slăbită, ceea ce ar putea explica activitatea mai redusă a enzimei pe ramurile cu legături α-1,6.

Domeniul secundar de legare a substratului

În complexul rhGAA-acarboză, am putut observa fracțiunea de acarvosină a unei a doua molecule de acarboză găzduită într-un buzunar din cadrul domeniului N-terminal trefoil de tip P, situat pe aceeași față a rhGAA unde se află situsul activ și la 25 Å distanță de acarboza legată în acesta (Fig. 4c). Fracțiunea valienamină se leagă prin legături de hidrogen cu grupările sale 4- și 6-hidroxilice de azotul și oxigenul lanțului principal al C127, de oxigenul lanțului principal al A93 și de lanțul lateral al D91. Alte interacțiuni stabilizatoare sunt asigurate de interacțiunile de suprapunere cu P125 și W126. P125 și D91 sunt conservate sau înlocuite prin substituții conservatoare în enzimele din familia GH31 care cuprind un domeniu trefoil de tip P (figura suplimentară 4a). Adiacent la situsul secundar de legare a carbohidraților, bucla de suprafață G116-M122 a fost tăiată prin tratament proteolitic. Este posibil ca îndepărtarea segmentului G116-M122, unic la reprezentanții lizozomali ai familiei GH31 (Fig. suplimentară 4a, b), să contribuie la formarea buzunarului secundar de legare a substratului. S-ar putea considera că situsul secundar de legare a acarbozei de pe rhGAA reprezintă un situs autentic de legare a substratului, ceea ce ar putea spori procesivitatea enzimei. Acest sit ar putea reprezenta, de asemenea, un farmacofor pentru depistarea in silico a unor noi chaperoni farmacologici. În special, o trisacaridă derivată din acarboză este legată de domeniul N-terminal al familiei GH31 α-1,4-glucan lipaza din Gracilariopsis lemaneiformis 33 într-o poziție apropiată de situsul secundar de legare a substratului descris aici (Fig. suplimentară 5).

N-acetilcisteina este un chaperon farmacologic alosteric

Cunoscutul medicament farmaceutic N-acetilcisteină (NAC) s-a dovedit a acționa ca un chaperon farmacologic alosteric care îmbunătățește stabilitatea GAA endogene mutante și rhGAA utilizate pentru ERT, fără a afecta activitatea catalitică18. Pentru a valorifica potențialul terapeutic al NAC pentru boala Pompe prin studii structurale, am urmărit structura cristalină a rhGAA în complex cu NAC. Structura complexului la o rezoluție de 1,83 Å, obținută prin experimente de înmuiere a cristalelor (tabelul 1), relevă două situsuri de legare a NAC la distanță de situsul activ (Fig. 4d, e), oferind dovezi structurale că NAC este într-adevăr o chaperonă alosterică, așa cum au anticipat studiile funcționale18. Ne-am asigurat, prin intermediul testelor de activitate și al fluorimetriei de scanare diferențială, că NAC stabilizează la fel de bine rhGAA și enzima maturizată proteolitic produsă în acest studiu și că chaperonul este specific pentru GAA, deoarece NAC nu are niciun efect stabilizator asupra unui omolog GH31 din orez (Fig. suplimentară 6a, b și tabelele suplimentare 3 și 4). În structura complexului rhGAA-NAC, o moleculă de NAC, desemnată ca NAC1, este situată la aproximativ 30 Å distanță de situsul activ, la interfața dintre butoiul (β/α)8 și domeniul β-sheet distal (Fig. 4d). NAC1 se leagă de carboxilul lanțului principal al H432 prin intermediul azotului său amidic, iar funcția carboxil face un contact mediat de apă cu lanțul lateral al D513. Grupurile Cβ-Sγ și acetil stabilesc interacțiuni de stivuire cu grupul guanidină din R437 și, respectiv, cu bucla G434-G435. O a doua moleculă de NAC, parțial (75%) ocupată (NAC2), este găzduită la interfața dintre butoiul (β/α)8 și domeniul β-sheet proximal la o distanță de 25 Å de situsul activ (Fig. 4e). Funcția carboxil a NAC2 realizează un contact mediat de apă cu oxigenul lanțului principal al lui L756, tiolul se suprapune pe lanțul lateral al lui Q757, iar grupul acetil se suprapune pe lanțul lateral al lui H742. Cele două molecule de NAC stabilesc interacțiuni mai puține și mai slabe cu rhGAA decât chaperonii DNJ și NHE-DNJ. Acest lucru reflectă concentrațiile mai mari de NAC necesare pentru activitatea de chaperon (mM față de µM), așa cum este exemplificat de K D de 11,57±0,74 mM pe care l-am obținut prin fluorimetrie diferențială de scanare și de K i de 3,4 și 3,0 µM pentru DNJ și, respectiv, NHE-DNJ18,29. O curbă de saturație sigmoidală care se potrivește cel mai bine punctelor experimentale susține situsurile de legare alosterică NAC complet (NAC1) și parțial (NAC2) ocupate (Fig. Suplimentară 6c). Interacțiunile de stivuire stabilite între grupele acetil ale NAC1 și NAC2 și rhGAA trebuie să contribuie semnificativ la energia de legare, deoarece aminoacizii înrudiți cu NAC, cum ar fi N-acetilserina și N-acetilglicina, au în egală măsură un efect stabilizator asupra rhGAA, în timp ce omologii neacetilați nu au niciun efect18. Structura complexului rhGAA-NAC arată o scădere a parametrilor de deplasare termică atomică a reziduurilor care înconjoară situsurile de legare a NAC în comparație cu cea a rhGAA nelegate, ceea ce indică o funcție stabilizatoare globală interdomeniu determinată de NAC (Fig. suplimentară 7a-d). În cristal, NAC pare să exercite, de asemenea, un efect antioxidant, deoarece reziduul C938 este oxidat la forma de acid sulfenic în toate structurile cristaline descrise aici, cu excepția structurii complexului rhGAA-NAC (Fig. suplimentară 8a, b).

NAC și iminosugarii prezintă profiluri de chaperonare diferite

Câteva mutații care duc la boala Pompe răspund atât la NAC, cât și la iminosugarii DNJ și NB-DNJ, în timp ce altele sunt vizate în mod specific de unul sau de celălalt chaperon farmacologic16,17,18. Marea majoritate a mutanților GAA care răspund la activitatea de chaperon a iminosugarilor sunt localizați fie în apropierea situsului activ, fie pe elemente structurale care contribuie la arhitectura globală a acestuia. La pacientul Pompe, la fibroblastele și la modelele de șoareci, mutanții GAA care răspund cel mai bine la NAC (A445P, Y455F și L552P)18 sunt localizați pe inserțiile I și II, unde reziduurile de tip sălbatic corespunzătoare contribuie la stabilizarea domeniului. A445, împreună cu F487, definește limitele inserției I, iar mutantul A445P destabilizează cel mai probabil întregul schelet al inserției I (Fig. suplimentară 9a). Hidroxilul lanțului lateral al lui Y455 de pe insertul I interacționează cu o buclă lungă a domeniului catalitic, în timp ce lanțul lateral al lui L552 de pe insertul II realizează interacțiuni hidrofobe cu reziduuri din domeniul β-sheet N-terminal (Fig. suplimentară 9b, c). Mutanții Y455F și L552P respectivi au cu siguranță un efect destabilizator global, care este în mod clar salvat de NAC. Prin urmare, acțiunea chaperonică a iminosugarilor poate fi considerată ca o salvare conformațională a situsurilor active perturbate structural, în timp ce efectul chaperonului alosteric NAC pare să se datoreze stabilizării fluctuațiilor conformaționale globale sau locale.

.