Studii de stabilitate a tiocolchicosidei în vrac și capsule utilizând RP-HPTLC/Densitometrie

Abstract

A fost dezvoltată și validată o nouă metodă cromatografică în strat subțire de înaltă performanță cu fază inversă (RP-HPTLC) care indică stabilitatea pentru analiza densitometrică a tiocolchicosidei. Cromatogramele au fost dezvoltate folosind plăci de aluminiu preacoperite cu silicagel 60 RP-18 F254S ca fază staționară și metanol : apă (70 : 30 ) ca fază mobilă. Banda compactă pentru tiocolchicosidă a fost observată la o valoare de la o lungime de undă de absorbție de 377 nm. Datele de regresie liniară pentru diagramele de calibrare () au fost găsite în ceea ce privește zona de vârf în intervalul de concentrație de 100-600 ng pe bandă. Limita de detecție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) au fost de 9,77 ng și, respectiv, 29,63 ng. Medicamentul a fost expus la hidroliză acidă și alcalină, oxidare, fotodegradare și condiții de căldură uscată. Vârfurile produselor de degradare au fost bine delimitate de vârful medicamentului standard cu valori semnificativ diferite. Analiza statistică a dovedit că metoda RP-HPTLC stabilită este reproductibilă, selectivă și precisă pentru determinarea tiocolchicosidei în formulările sale. Metoda poate separa în mod eficient medicamentul de produșii săi de degradare și poate fi considerată ca o analiză care indică stabilitatea.

1. Introducere

Tiocolchicosida este din punct de vedere chimic 2-demethoxy-2-glucosidoxythicolchicină (figura 1) . Tiocolchicosida este un derivat semisintetic sulfurat al colchicosidei, o glucozidă naturală prezentă în planta Gloriosa superba. Din punct de vedere clinic, tiocolchicosida este utilizată pentru proprietățile relaxante musculare, antiinflamatorii și analgezice . Au fost stabilite puține metode LC-MS-MS pentru evaluarea bioechivalenței tiocolchicosidei ca și componentă unică și în comprimate combinate în doză fixă cu lornoxicam .

Figura 1

Structura chimică a tiocolchicosidei.

Au fost stabilite unele metode analitice, cum ar fi LC-ESI-MS RP-HPLC și UV-Spectrofotometrică pentru determinarea tiocolchicosidei singure în vrac și în formulări farmaceutice.

Tiocolchicosida este disponibilă în combinație cu multe alte medicamente; prin urmare, au fost studiate mai multe metode, cum ar fi metodele UV-Spectrofotometrice , RP-HPLC și HPTLC, pentru determinarea tiocolchicosidei în forme farmaceutice combinate.

Legitimările Conferinței Internaționale de Armonizare (ICH) intitulate „Testarea stabilității substanțelor și produselor medicamentoase noi” prevăd că se pot efectua teste de stres pentru a elucida caracteristicile inerente de stabilitate ale substanței active. O metodă ideală de indicare a stabilității este cea care rezolvă atât medicamentul standard, cât și produsele de degradare ale acestuia . Prin urmare, trebuie dezvoltată o metodă de determinare fiabilă și rapidă, care ar putea fi, de asemenea, utilizată pentru a obține separarea optimă a componentelor de degradare de compusul mamă. Cu toate acestea, după cunoștințele noastre, în literatura de specialitate nu a fost menționat niciun articol referitor la determinarea prin RP-HPTLC a tiocolchicosidei care să indice stabilitatea. Obiectivul lucrării descrise în această lucrare este de a stabili condițiile pentru identificarea și analiza cantitativă a tiocolchicosidei în prezența produșilor săi de degradare pentru evaluarea purității medicamentului în vrac și a stabilității formelor sale farmaceutice. Caracterul adecvat al metodei RP-HPTLC cu indicație de stabilitate pentru determinarea cantitativă a tiocolchicosidei a fost dovedit prin validare în conformitate cu cerința ghidurilor ICH .

2. Experimental

2.1. Substanțe chimice și reactivi

Tiocolchicosida a fost obținută ca eșantion cadou de la Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, India. Metanolul de calitate HPLC, HCl, NaOH și H2O2 au fost achiziționate de la Merck Chemicals, India.

2.2. Instrumentația HPTLC

Standardul de medicament și probele au fost punctate sub formă de benzi de 6 mm lățime cu o seringă de microlitru CAMAG Linomat (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Elveția) folosind un aplicator de 5 probe CAMAG Linomat (CAMAG Linomat 5-sample applicator) (CAMAG Muttenz, Elveția) cu o rată constantă de aplicare, 150 nL pe secundă. Plăcile au fost spălate în prealabil cu metanol și activate la 100 °C timp de 10 minute înainte de cromatografie. Cromatografia a fost efectuată pe plăci de aluminiu preacoperite cu silicagel 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Germania). Dezvoltarea liniară ascendentă cu metanol: apă (70 : 30 v/v) ca fază mobilă a fost realizată într-o cameră de sticlă cu două cuve de 20 × 10 cm (CAMAG Muttenz, Elveția). Timpul optimizat de saturație a camerei pentru faza mobilă a fost de 30 de minute la temperatura camerei (28 ± 2°C). Lungimea parcursului cromatogramei a fost de aproximativ 80 mm. Timpul de dezvoltare a plăcii a fost de 25 min. După dezvoltare, plăcile au fost uscate în curent de aer cu ajutorul unui uscător de aer. Detectarea spotului a fost apoi efectuată la 377 nm cu un scaner CAMAG TLC Scanner 3 în modul absorbție, operat de software-ul winCATS versiunea 1.3.0. Sursa de radiație a fost o lampă cu deuteriu. Dimensiunile fantei au fost de 6 mm × 0,45 mm, iar viteza de scanare, de 20 mm pe secundă.

2.3. Prepararea standardului stoc

Soluție standard stoc de 1 mg/mL de tiocolchicosidă în metanol.

2.4. Studiu de liniaritate

Soluția standard de stoc în intervalul 0,2 – 1,2 mL a fost transferată în șase baloane volumetrice separate de 10 mL, iar volumul a fost completat cu metanol. Din fiecare dintre soluțiile de mai sus, 5 μL au fost aplicate pe plăci RP-HPTLC pentru a obține concentrații în intervalul 100-600 ng pe bandă. Graficul de calibrare pentru metodă a fost construit ca fiind aria vârfului în funcție de concentrația medicamentului.

2.5. Pregătirea soluției de probă

Pentru a determina conținutul de tiocolchicosid în capsulă, douăzeci de capsule (MYORIL, mențiunea de pe etichetă: 8 mg de tiocolchicosid pe capsulă) au fost cântărite; conținutul capsulelor a fost îndepărtat; și s-a determinat greutatea medie. O cantitate echivalentă cu 8 mg de tiocolchicosidă a fost transferată într-un balon volumetric de 100 ml care conținea 50 ml de metanol și a fost sonicată timp de 10 minute; volumul a fost ajustat la semn și filtrat cu hârtie de filtru Whatmann nr. 41. Un volum de 5 ml a fost diluat la 10 ml cu metanol; soluția rezultată de 5 μL a fost aplicată pe placa RP-HPTLC pentru determinarea tiocolchicosidei. Plăcile au fost developate și scanate conform descrierii de mai sus.

2.6. Validarea metodei

Metoda a fost validată pentru următorii parametri în conformitate cu liniile directoare ICH.

2.6.1. Precizia

Repetabilitatea aplicării probei și măsurarea ariei de vârf au fost efectuate utilizând șase replici ale concentrației de testare (400 ng pe bandă de tiocolchicosidă). Variația intra- și interzilnică pentru estimarea tiocolchicosidei a fost efectuată folosind trei replici la trei niveluri diferite de concentrație (200, 300 și 500 ng pe bandă).

2.6.2. Limita de detecție (LOD) și limita de cuantificare (LOQ)

Pentru a determina limita de detecție și de cuantificare, au fost utilizate concentrații de tiocolchicosidă în partea inferioară a intervalului liniar al curbei de calibrare. Din soluția standard stoc, tiocolchicosidul 100, 120, 120, 140, 160, 180 și 200 ng pe bandă a fost aplicat în triplu exemplar pe placa RP-HPTLC, iar LOD și LOQ au fost calculate cu ajutorul următoarelor ecuații: unde „” este abaterea standard a ariilor de vârf ale medicamentelor (), luată ca măsură a zgomotului și „” este panta curbei de calibrare corespunzătoare.”

2.6.3. Specificitatea

Specificitatea metodei a fost verificată prin analizarea standardului de medicament și a probei. Banda pentru tiocolchicosidă din probă a fost confirmată prin compararea valorilor și spectrelor benzii cu cele ale standardului de medicament. Puritatea vârfului de tiocolchicosidă a fost confirmată prin compararea spectrelor la trei niveluri diferite, adică pozițiile vârfului de început (), vârf-apex () și vârf-final () ale benzii.

2.6.4. Rezistența

Rezistența metodei a fost realizată prin analizarea a 400 ng de tiocolchicosidă de către doi analiști diferiți, păstrând aceleași condiții experimentale și de mediu.

2.6.5. Precizia

Nouă benzi de soluție de probă de tiocolchicosidă (200 ng pe bandă) au fost aplicate pe placă, iar apoi cantitatea cunoscută de tiocolchicosidă a fost aplicată în triplu exemplar la 80, 100 și 120% (160, 200 și 240 ng pe bandă) din concentrația probei (200 ng pe bandă) și reanalizată prin metoda propusă. Acest lucru a fost realizat pentru a evalua studiul de recuperare a medicamentului la diferite niveluri în formulări.

2.6.6. Robustețe

Prin efectuarea unor mici modificări compoziția fazei mobile, cantitatea de fază mobilă, timpul de la aplicare la dezvoltare și timpul de la dezvoltare la scanare au fost examinate efectele asupra rezultatelor. Au fost încercate faze mobile având diferite compoziții de metanol: apă (72 : 28 v/v) și metanol: apă (68 : 32 v/v) și au fost rulate cromatograme. Plăcile au fost pre-spălate cu metanol și activate la 80 ± 5°C timp de 2, 5 și 8 minute înainte de cromatografie. Robustețea metodei a fost realizată folosind șase replici ale aceluiași spot (400 ng pe bandă de tiocolchicosidă).

2.7. Degradarea forțată a tiocolchicosidei

2.7.1. Hidroliza acidă și bazică

Cantitatea de 10 mg de tiocolochicosidă cântărită cu exactitate a fost dizolvată separat în 10 ml de soluție metanolică de HCl 1,0 M și, respectiv, NaOH 0,5 M și refluxată timp de 30 min la 60°C la întuneric pentru a evita efectul degradant probabil al luminii. Un volum de 1,0 ml din soluțiile de mai sus a fost prelevat separat, neutralizat și diluat până la 10 ml cu metanol. Soluțiile rezultate au fost aplicate pe plăcile RP-HPTLC în triplicat (5 μL fiecare, adică 500 ng pe bandă). Cromatogramele au fost developate și scanate conform descrierii de mai sus.

2.7.2. Degradarea oxidativă

Pentru degradarea oxidativă, o cantitate cântărită cu precizie de 10 mg de tioclochicosidă a fost dizolvată separat în 10 ml de soluție metanolică de 1% v/v H2O2 și, respectiv, 3% v/v H2O2, și menținută la întuneric la temperatura camerei timp de 30 min. După 30 min, s-a prelevat 1,0 ml din fiecare dintre soluțiile de mai sus și s-a diluat până la 10 ml cu metanol. Soluțiile rezultate au fost aplicate pe plăci RP-HPTLC în triplu exemplar (5 μL fiecare, adică 500 ng pe bandă). Cromatogramele au fost developate și scanate conform descrierii de mai sus.

2.7.3. Degradarea la căldură uscată

Cantitatea de 10 mg de tiocolchicosidă cântărită cu exactitate a fost depozitată la 70°C timp de 8 h într-un cuptor. A fost transferată într-un balon volumetric de 10 ml conținând metanol și volumul a fost completat până la semn. S-a luat 1,0 ml din soluția de mai sus și s-a diluat până la 10 ml cu metanol. Soluția rezultată a fost aplicată pe placa RP-HPTLC în triplu exemplar (5 μL fiecare, adică 500 ng pe bandă). Cromatograma a fost developată și scanată conform descrierii de mai sus.

2.7.4. Fotodegradarea

Cantitatea de 10 mg de tiocolchicosidă cântărită cu exactitate a fost dizolvată în 10 ml de metanol și soluțiile au fost păstrate pentru o perioadă de 24 h la lumină. S-a luat un volum corespunzător 1,0 mL din soluția de mai sus și s-a diluat până la 10 mL cu metanol. Soluția rezultată a fost aplicată pe placa RP-HPTLC în triplu exemplar (5 μL fiecare, adică 500 ng pe bandă). Cromatograma a fost dezvoltată și scanată conform descrierii de mai sus.

3. Rezultate și discuții

3.1. Dezvoltarea fazei mobile optime

Pentru selectarea fazei mobile adecvate pentru separarea tiocolchicosidei, s-au efectuat mai multe teste folosind faze mobile care conțin solvenți cu diferite polarități, la diferite niveluri de concentrație. Dintre diferitele combinații de faze mobile utilizate, faza mobilă compusă din metanol: apă (70 : 30 v/v) a dat un vârf ascuțit și bine definit la valoarea de 0,60 ± 0,02 (figura 2). Benzile bine delimitate au fost găsite atunci când camera a fost saturată cu faza mobilă timp de 30 de minute la temperatura camerei.

Figura 2

Cromatograma etalonului de tiocolchicosidă cu ( 0,60 ± 0,02) la 377 nm în metanol: apă (70 : 30 v/v) ca fază mobilă.

3.2. Curba de calibrare

Datele de regresie liniară pentru curbele de calibrare () au arătat o bună relație liniară pe intervalul de concentrație de 100-600 ng pe bandă. Ecuația de regresie liniară s-a dovedit a fi , = 0,9984 (Figura 3).

Figura 3

Curba de calibrare a tiocolchicosidei (100-600 ng pe bandă).

3.3. Validarea metodei

Metoda dezvoltată a fost validată în conformitate cu liniile directoare ICH.

Precizia metodei a fost evidențiată în termeni de % deviație standard relativă (% RSD) a zonei de vârf. Rezultatele (tabelul 1) au epitomizat sunetele precizia metodei, care au fost determinate din panta celei mai mici părți a graficului de calibrare. LOD și LOQ s-au dovedit a fi de 9,77 ng și, respectiv, 29,63 ng, ceea ce indică faptul că sensibilitatea metodei este adecvată.

Studiile de recuperare au fost executate la 80%, 100% și 120% din concentrația de testare, în conformitate cu orientările ICH. S-a constatat că procentul de recuperare a tiocolchicosidei la toate cele trei niveluri s-a situat în intervalul 99,92-100,04%. Cantitățile de medicament adăugate și determinate și procentul de recuperare sunt prezentate în (tabelul 2). Puritatea vârfului de tiocolchicosidă a fost confirmată prin evaluarea studiilor spectrelor la pozițiile de început de vârf, vârf-apex și sfârșit de vârf ale benzii, adică (, ) = 0,9995 și (, ) = 0,9986, ceea ce arată specificitatea metodei (figura 4). S-a obținut o bună corelație ( = 0,9989) între standardul de medicament și medicamentul extras din formula capsulei. Robustețea metodei a fost experimentată prin modificarea intenționată a condițiilor cromatografice, iar efectul asupra cromatogramei a fost observat. S-a calculat deviația standard a zonelor de vârf pentru fiecare parametru, iar % RSD s-a dovedit a fi mai mică de 2 %. Valorile scăzute ale valorilor % RSD indică robustețea metodei; rezultatele sunt prezentate în (tabelul 3). Robustețea metodei a fost verificată de către diferiți analiști și s-a constatat că % RSD a fost de 0,57 și 0,58, ceea ce indică faptul că metoda este robustă.

Figura 4

Spectrele de maximă puritate ale tiocolchicosidei standard (a) și ale tiocolchicosidei extrase din capsulă (b) scanate la pozițiile peak-start, peak-apex și peak-end.

3.4. Analiza formulării comercializate

Tiocolchicosida, atunci când a fost extrasă din formula capsulei, a demonstrat un singur punct având = 0,60 ± 0,02 în cromatogramă. S-a constatat că procentul mediu de conținut de medicament a fost de 100,27 % din declarația de pe etichetă, cu 0,88 % RSD.

3.5. Proprietatea indicatoare de stabilitate

3.5.1. Degradarea acidă

Degradarea forțată a tiocolchicosidei în HCl 1,0 M (60°C timp de 30 min) s-a dovedit a fi instabilă și a prezentat două vârfuri suplimentare la valorile 0,33 și 0,71 (figura 5(a)). Petele de produse degradate au fost bine separate de pata de tiocolchicosidă.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 5

RP-Cromatogramele HPTLC obținute din tiocolchicosida degradată prin (a) hidroliză acidă (HCl 1 M), (b) hidroliză alcalină (0.5 M NaOH), (c) stresul oxidativ (1% v/v H2O2), și (d) stresul oxidativ (3% v/v H2O2).

3.5.2. Degradarea bazică

Tiocolchicosida s-a dovedit a fi instabilă în timpul hidrolizei alcaline în NaOH 0,5 M la 60°C timp de 30 min. Medicamentul a prezentat un vârf suplimentar la valoarea 0,72, tiocolchicosida rămânând la 0,60 (Figura 5(b)). Petele de produse degradate au fost bine separate de petele de medicament.

3.5.3. Degradarea oxidativă

Tiocolchicosida posedă un atom de sulf, care este mai susceptibil la oxidare de către H2O2. După tratarea tiocolchicosidei cu 1% v/v H2O2, au fost observate trei vârfuri suplimentare la valorile 0,38, 0,46 și 0,70, împreună cu tiocolchicosida rămasă la 0,60 (figura 5(c)). În cazul degradării oxidative cu 3% v/v H2O2, tiocolchicosida a suferit o degradare completă, rezultând două vârfuri majore la valorile 0,58 și 0,64 și, respectiv, un vârf la 0,70 [figura 5(d)]. Spectrele de pic-puritate ale tiocolchicosidei recuperate după degradarea în HCl 1 M, NaOH 0,5 M și H2O2 1% v/v și ale standardului de tiocolchicosidă scanat la pozițiile de început de vârf, vârf-apex și sfârșit de vârf ale spotului sunt prezentate în (figura 6). Rezultatele studiilor de testare la stres au arătat că metoda a fost foarte specifică pentru tiocolchicosidă. Produsele de degradare au fost în întregime observabile față de compusul de origine. Nu a fost identificată nicio descompunere la expunerea soluției de medicament la lumina soarelui în timpul fotodegradării și al degradării termice, ceea ce indică stabilitatea medicamentului în ambele condiții. Rezultatele studiului de degradare forțată a tiocolchicosidei sunt rezumate în (tabelul 4).

Condiții de stres Temperatură % Recuperare () Tiocolchicosidă pică-1 pică-2 pică-3 1.0 M HCl 60°C 78.00 (0.60) 8.22 (0.33) 13.78 (0.71) 0.5 M NaOH 60°C 85 (0.60) 15 (0.72) – – 1% v/v H2O2 RT 67.50 (0.60) 2.18 (0.38) 10.20 (0.46) 20.12 (0.70) Fotodegradare-lumină de zi (8 h/zi) RT 92.94 (0,60) – – – Căldura uscată 70°C 98.12 (0,60) – – –

RT: Temperatura camerei.

Tabelul 4

Studii de degradare forțată.

Figura 6

Spectrele de maximă puritate ale tiocolchicosidei recuperate după degradarea în HCl 1 M, 0.5 M NaOH, 1% v/v H2O2, degradanți și standard de tiocolchicosidă scanat la pozițiile peak-start, peak-apex și peak-end.

4. Concluzii

În studiul de față, s-a realizat degradarea forțată a tiocolchicosidei pentru a elucida stabilitatea chimică inerentă a acesteia. În acest scop a fost elaborată o metodă RP-HPTLC. Metoda dezvoltată s-a dovedit a fi simplă, rapidă, selectivă, sensibilă și adecvată pentru determinarea tiocolchicosidei în materialul vrac și în formularea capsulelor. În timpul studiului, s-a constatat că tiocolchicosida este sensibilă la hidroliza acidă și bazică, precum și la oxidare. Deoarece metoda este una care indică stabilitatea, aceasta poate fi utilizată pentru a determina puritatea medicamentului disponibil din diferite surse prin detectarea impurităților aferente. În plus, se poate concluziona că impuritățile prezente în medicament ar putea fi datorate hidrolizei sau oxidării în timpul procesării și depozitării medicamentului.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese.

Recunoștințe

Autorii mulțumesc Institutului R. C. Patel de Educație și Cercetare Farmaceutică, Shirpur (M.S.), India, pentru că a oferit facilitățile necesare pentru realizarea acestei lucrări de cercetare.

.