Principiile de asamblare învățate din studiile in vitro
Subunitățile ribozomale 30S și 50S bacteriene funcționale pot fi reconstituite in vitro din ARNr și fiecare dintre proteinele ribozomale. Studiile detaliate ale principiilor biochimice și biofizice care stau la baza asamblării ribozomului in vitro au oferit paradigme utile pentru a ghida investigațiile privind biogeneza ribozomului in vivo.
Unul dintre primele principii dezvăluite de aceste experimente este acela că asamblarea proteinelor r în subunități ribozomale are loc într-o manieră ierarhică. Studiile de reconstituire a subunităților ribozomale 30S bacteriene au definit o „hartă de asamblare” pentru ordinea de asociere a fiecărei proteine r cu ARNr. Pe baza ordinii lor în ierarhia de legare, r-proteinele sunt desemnate ca fiind primare (se leagă direct de ARNr), secundare (legarea depinde de proteinele de legare primare) sau terțiare (legarea depinde de proteinele de legare secundare). Deși o astfel de hartă de dependență s-a dovedit a fi un punct de plecare foarte util, aceasta nu oferă nicio informație privind cinetica de legare a proteinelor. Mai degrabă, calea de asamblare poate reflecta în mare măsură ordinea în care fiecare proteină r este asociată cel mai stabil cu ARNr. În plus, harta de asamblare nu ia în considerare nici calea de pliere a ARNr 16S independent de proteinele r, nici rolul în asamblarea ribozomului al procesării nucleolitice a precursorilor ARNr care are loc in vivo. Mai recent, aceste aspecte ale asamblării subunității 30S au fost explorate mai detaliat cu ajutorul unor tehnici cum ar fi sondarea chimică și a radicalilor hidroxilici a conformației ARN pentru a evalua modificările în timp ale conformației rRNP și spectrometria de masă cu impulsuri (PC/MS) pentru a determina cinetica legării r-proteinei la ARNr.
O posibilă explicație pentru observarea în harta de asamblare a r-proteinelor cu legare primară este aceea că situsurile lor de legare sunt create cel puțin în parte de conformația adoptată de ARNr 16S independent de r-proteine. De fapt, în concordanță cu această idee și cu părerea că ribozomii au evoluat de la un catalizator de ARN, s-a demonstrat că domeniul 5′ al ARNr 16S se poate plia și poate forma contacte terțiare în absența tuturor r-proteinelor. Se presupune că această structură terțiară nu este complet stabilă în absența contactelor proteice și, prin urmare, este cel mai probabil stabilizată de legarea r-proteinelor la situsurile create de conformațiile tranzitorii adoptate de ARNr în timpul pliajului. Prin urmare, cel de-al doilea principiu sugerează că plierea ARNr asigură baza legării r-proteinei r în timpul asamblării ribozomului.
Un al treilea principiu care a reieșit din studiile in vitro ale ribozomilor bacterieni este acela că întărirea legării r-proteinei r cu ARNr are loc pe măsură ce asamblarea ribozomului progresează. Multe r-proteine intră în contact cu mai multe nucleotide de pe ARNr. Analiza amprentei radicalice hidroxilice rezolvate în timp a arătat că unele dintre aceste nucleotide sunt protejate înaintea altora, sugerând că, pe măsură ce biogeneza ribozomilor avansează, r-proteinele stabilesc mai multe contacte cu ARNr, devenind astfel mai stabil integrate cu ribozomii.
Stabilirea inițială a câtorva contacte între r-proteine și ARNr stabilizează potențial anumite conformații ale ARN și induce modificări în conformația ARNr pentru a oferi situsuri de legare pentru r-proteine suplimentare (secundare sau terțiare). Prin urmare, legarea r-proteinei consolidează câștigurile de pliere a ARN și conferă direcționalitate procesului de asamblare. Acest lucru sugerează un model în care asamblarea decurge printr-o serie alternantă de modificări conformaționale ale ARN și de legare a proteinelor, care stabilizează secvențial structura finală a ARN. Datele cinetice au arătat că asamblarea subunităților 30S mature are loc prin intermediul mai multor căi paralele de pliere a ARN-ului, toate convergând spre produsul final. Acest lucru a condus la conceptul de peisaj de asamblare, spre deosebire de o cale unică pe care are loc asamblarea subunităților ribozomiale.
În cele din urmă, studiile in vitro au arătat că asamblarea ribozomilor are loc în direcția 5′ spre 3′. PC/MS și sondarea chimică a structurii secundare a ARNr au arătat că legarea proteinei r la domeniul 5′ al ARNr poate fi observată înainte de stabilirea contactelor proteice cu domeniul 3′ al ARNr. Dimpotrivă, testele de determinare a amprentei radicalului hidroxil au arătat o explozie inițială de protecție a nucleotidelor de-a lungul ARNr 16S, ceea ce indică faptul că plierea ARN-ului pornește din mai multe situsuri diferite răspândite de-a lungul ARN-ului, indicând astfel lipsa direcționalității 5′ spre 3′ în asamblare. Aceste observații contradictorii pot fi reconciliate prin luarea în considerare a naturii diferitelor configurații experimentale. PC/MS măsoară cinetica de legare a proteinelor la ARNr și, ca atare, pot fi detectate numai interacțiunile stabile între r-proteine și ARNr, deoarece r-proteinele care se leagă slab în timpul impulsului pot fi spălate în timpul urmăririi. Pe de altă parte, testele Footprinting pot capta protecția nucleotidelor atât de către r-proteinele cu interacțiune slabă, cât și de cele cu asociere stabilă. Luate împreună, aceste date indică faptul că, în timp ce asamblarea ribozomului se poate nuclea de-a lungul întregului ARNr, asocierea strânsă finală a r-proteinelor cu ARNr are loc în direcția 5′ spre 3′.
Este important să se ia în considerare modul în care aceste experimente in vitro ar putea sau nu să reflecte asamblarea in vivo. De exemplu, atunci când are loc asamblarea ribozomului in vivo, aceasta este cuplată cu transcrierea ARNr, care, de asemenea, se presupune că contribuie la direcționalitatea 5′ către 3′ observată a asocierii r-proteinei. ARNr ar fi putut evolua pentru a se plia 5′ către 3′ pe măsură ce este sintetizat și pentru a încorpora astfel r-proteinele, cuplând astfel asamblarea cu transcrierea ARNr. Mai mult, cerința unei etape de încălzire în timpul reconstituirii subunităților ribozomale in vitro și identificarea unui număr de mutanți bacterieni care sunt defectuoși în producerea de ribozomi indică necesitatea unor factori de acțiune trans în timpul biogenezei ribozomale in vivo.
.