În timp ce testele pentru proteine au o varietate de utilizări în cercetarea în științele vieții, nu există o singură metodă de testare care să fie potrivită pentru toate aplicațiile. În ciuda tuturor progreselor din știința modernă, nu există o metodă de testare a proteinelor care să nu fie afectată de componentele neproteice sau de diferențele în compoziția proteinelor. Din acest motiv, laboratoarele de proteine consideră că este necesar să aibă mai mult de un tip de analiză a proteinelor pentru aplicațiile de cercetare.
Care analiză are propriile avantaje și limitări. Astfel, dacă doriți să obțineți rezultate precise din experimentul dumneavoastră, ar trebui să puteți selecta testul cel mai potrivit pentru aplicația dumneavoastră.
Tipuri de teste colorimetrice pentru proteine
În funcție de chimia implicată, cele două metode cele mai comune pentru detectarea și cuantificarea colorimetrică a proteinelor totale sunt testul de legare a colorantului proteic și/sau testul de chelare pe bază de ioni de cupru.
Sesizări de legare a coloranților
Sesizările de legare a coloranților, cum ar fi testele de proteine Bradford (Coomassie) și 660nm, se bazează pe legarea moleculelor de proteine la colorantul Coomassie în condiții acide. Odată ce moleculele de proteine se leagă de colorant, culoarea trece de la maro (Amax= 465nm) la albastru (Amax= 610nm). Schimbarea densității culorii (care se citește la 595nm) este proporțională cu concentrația de proteine.
Aminoacizii bazici (arginină, lizină și histidină) joacă un rol vital în formarea complexelor colorant-proteină și în schimbarea spectrală rezultată, în timp ce proteinele mai mici (mai puțin de 3kDa) și aminoacizii nu produc schimbări de culoare.
Sesizări pe bază de ioni de cupru
În analizele proteice pe bază de ioni de cupru, soluția de proteină este amestecată cu o soluție alcalină de sare de cupru pentru a facilita chelarea ionilor cuprici (Cu2+) cu legăturile peptidice și reducerea ulterioară a ionilor cuprici (Cu2+) la ioni cupri (Cu+). Orice exces de ioni de cupru va rămâne nelegat de legăturile peptidice și va fi disponibil pentru detectare.
Analizele proteice bazate pe ioni de cupru pot fi împărțite în două grupe – (1) analize care detectează ionii cuproși (Cu+) reduși și (2) analize care detectează ionii cuproși (Cu2+) nelegate. Acidul bicinchoninic (BCA) sau reactivul Folin (acid fosfomolibdic/ fosfotungstic) poate fi utilizat pentru a detecta ionii cuprului. La reducerea reactivului utilizat, se produce o culoare albastră. Cantitatea de culoare produsă poate fi citită la 650nm până la 750nm și este proporțională cu cantitatea de legături peptidice.
Nota: Prezența tirozinei, triptofanului, cisteinei, histidinei și aspargininei în proteine sporește densitatea culorii rezultate.
În testele bazate pe detectarea ionilor cupriici nelegate, cuprul alcalin se amestecă cu soluția de proteină și ionii cupriici nelegate sunt apoi detectați cu un reactiv care produce culoare și care reacționează cu ionii cupriici. Cantitatea de culoare produsă este invers proporțională cu cantitatea de legătură peptidică din probă.
Selecting Protein Assays: Câțiva factori de luat în considerare
Există o serie de factori pe care trebuie să îi luați în considerare atunci când alegeți un test. Iată câțiva dintre ei.
- Compatibilitatea cu tipul de probă și componentele acesteia. Natura probei de proteine și prezența agenților neproteici în soluțiile de proteine pot afecta semnificativ rezultatele experimentului dumneavoastră. Rețineți că prezența agenților reducători, a agenților de chelare a metalelor, a coloranților, a aminelor și a zaharurilor interferează cu testele proteice pe bază de cupru, în timp ce soluțiile proteice care conțin detergenți interferează cu testele proteice pe bază de coloranți.
- Intervalul de testare și volumul de probă necesar. Majoritatea testelor colorimetrice necesită cel puțin 0,5µg de proteine pentru o estimare fiabilă. Astfel, pentru probele greu de obținut, ar trebui luate în considerare metodele care necesită cea mai mică cantitate de probă pentru o estimare fiabilă.
- Uniformitatea între proteine. Testele proteice pe bază de coloranți și cele care implică reducerea ionilor cuprului în ioni cuprici prezintă variații semnificative de la proteină la proteină.
- Considerații privind timpul. Complexitatea probei și metoda de analiză aleasă dictează timpul de care aveți nevoie pentru a efectua analiza proteinelor. Probele de proteine care conțin agenți de interferență și testele care utilizează diagrame sau curbe standard vor consuma mai mult timp.
- Cerințe privind instrumentația. Disponibilitatea spectrofotometrului sau a cititorului de plăci necesare pentru a măsura culoarea produsă (absorbanța) de către analiză poate, de asemenea, să vă influențeze alegerea.
.