Testul de activare a bazofilelor: provocare alimentară în eprubetă sau instrument de cercetare specializată?

Standardul de aur pentru diagnosticul de alergie alimentară este provocarea alimentară orală (OFC). Cu toate acestea, OFC necesită ingestia alimentului suspectat a fi vinovat și poate provoca o reacție alergică acută, care este potențial severă . Din acest motiv, OFC trebuie să fie efectuată într-un mediu supravegheat, cu facilități și expertiză pentru a trata reacțiile alergice și anafilaxia, în cazul în care acestea apar. OFC poate provoca o anxietate semnificativă la pacienți, părinți și chiar la personalul clinic, deoarece implică un risc considerabil. Astfel, ori de câte ori este posibil, diagnosticul de alergie alimentară este stabilit printr-un istoric recent și convingător al unei reacții alergice mediate de IgE la alimentul vinovat, combinat cu dovezi de sensibilizare IgE la același aliment prin testul cutanat de înțepătură (SPT) și/sau IgE specifice serice (sIgE) . OFC sunt rezervate pentru cazurile în care rezultatele SPT și/sau sIgE sunt echivoce. Odată cu creșterea gradului de conștientizare și a prevalenței alergiilor alimentare și a sensibilizării la alimente, tot mai mulți pacienți sunt testați pentru alergii alimentare. Absența unui istoric de expunere orală la alimente alergenice, fie că a dus la o reacție alergică, fie în absența simptomelor clinice, poate face ca interpretarea rezultatelor SPT și sIgE să fie deosebit de dificilă. Sugarii și copiii mici care nu au consumat niciodată anumite alimente alergenice constituie o proporție considerabilă de pacienți consultați în clinicile de alergologie și au adesea nevoie de un OFC pentru a le clarifica statutul alergic. Acest lucru duce la creșterea cererii de efectuare a OFC. Serviciile de alergologie întâmpină dificultăți în a răspunde la această cerere și este posibil ca pacienții să fie nevoiți să aștepte mai multe luni înainte de a li se oferi un diagnostic exact de alergie alimentară sau toleranță alimentară prin OFC, ceea ce poate duce la restricții alimentare inutile și la o anxietate semnificativă asociată cu incertitudinea diagnosticului. OFC este, de asemenea, standardul de aur pentru a evalua rezoluția alergiei alimentare, pentru a determina doza prag și pentru a monitoriza răspunsul clinic la tratamentele imunomodulatoare pentru alergia alimentară. În cadrul studiilor de cercetare, pacienții alergici trebuie adesea să fie supuși unor OFC repetate pentru a evalua dacă a existat vreo ameliorare clinică.

BAT, fiind un test funcțional, are potențialul de a se asemăna mai mult cu fenotipul clinic al pacienților decât testele de alergie care doar detectează prezența IgE specifice alergenului. În termeni simpli, BAT poate fi văzut ca un OFC într-o eprubetă, în care, în loc să se administreze alimentul unui copil pe gură, bazofilele implicate în reacțiile alergice acute sunt expuse la un extract alimentar într-o eprubetă. În ciuda analogiei, pot fi evidențiate diferențe între cele două proceduri și aplicațiile clinice ale acestora și aici se pune întrebarea dacă BAT poate imita cu fidelitate standardul de aur OFC, adică dacă BAT poate reproduce in vitro reacția alergică care are loc in vivo în timpul unei OFC pozitive.

Testul de activare a bazofilelor

TESTUL BAT este un test bazat pe citometrie în flux în care se măsoară expresia markerilor de activare pe suprafața bazofilelor în urma stimulării cu alergen -Fig. 1. Un test de activare a bazofilelor pozitiv poate fi văzut ca un surogat in vitro al unei reacții alergice acute in vivo. Într-un studiu efectuat pe pacienți alergici la venin de himenoptere, s-a observat o reglare ascendentă a markerilor de activare a bazofilelor atât in vitro, în urma stimulării cu venin de jachetă galbenă sau de albină, cât și ex vivo, în urma unei provocări pozitive la înțepătură. În cadrul aceluiași studiu, a existat o concordanță generală între prezentarea clinică (reacție sistemică versus reacție locală amplă) și rezultatele BAT, sugerând că BAT este un potențial biomarker al anafilaxiei. De asemenea, la pacienții cu alergii alimentare s-a constatat o bună concordanță între rezultatele BAT și rezultatul OFC. La pacienții alergici la alfa-gal cu reacții alergice imediate întârziate de tip imediat la carnea roșie, activarea bazofilelor ex vivo în sângele recoltat la diferite momente de timp a coincis cu dezvoltarea de reacții alergice sistemice in vivo în timpul OFC . Rezultatele acestui studiu întăresc rolul bazofilelor în reacțiile alergice mediate de IgE induse de alimente și în anafilaxie.

Pentru identificarea bazofilelor în sângele integral se pot utiliza diferiți markeri de suprafață celulară, inclusiv IgE, CD123 (cu HLA-DR), CCR3 sau CRTH2 (cu CD3) sau CD203c .

În sângele periferic, IgE este detectată pe bazofile, celule dendritice, eozinofile, monocite, macrofage, celule B și trombocite, deci nu este specifică pentru bazofile. CD123 este subunitatea de joasă afinitate (α) a receptorului IL-3. Acesta este exprimat la niveluri ridicate pe celulele dendritice plasmocitoide și pe bazofile și la niveluri scăzute pe monocite, eozinofile, celule dendritice mieloide și subseturi de celule progenitoare hematologice. O colorație suplimentară cu HLA-DR face distincție între bazofilele HLA-DR-negative și celulele dendritice și monocitele HLA-DR-pozitive. CCR3 este receptorul pentru chemokinele de tip C-C (de exemplu, eotaxina, MCP și RANTES) și este puternic exprimat pe bazofile și eozinofile, dar și pe celulele Th1 și Th2. CRTH2 este un alt marker care este exprimat de bazofile, eozinofile și celule T și, prin urmare, ca și CCR3, necesită un marker al celulelor T, cum ar fi CD3, pentru a distinge bazofilele de celulele T. CD203c este exprimat constitutiv și specific pe bazofile și, prin urmare, poate fi utilizat ca un singur marker de identificare sau în combinație cu alți markeri.

În urma stimulării cu alergen, expresia diferitelor proteine este reglată la suprafața bazofilelor , și anume CD63 și CD203c . CD63 este o proteină de membrană asociată cu lizozomul (LAMP), care nu este exprimată pe suprafața bazofilelor în repaus, ci doar pe membrana granulelor din interiorul celulelor . Atunci când granulele fuzionează cu membrana plasmatică a bazofilelor în timpul degranulării, CD63 devine exprimată pe suprafața bazofilelor . CD203c este o enzimă care scindează legăturile fosfodiester și fosfosulfat, eliminând hidrolitic 5′-nucleotidele succesiv de la 3′-hidroxi-terminalele oligonucleotidelor. Este exprimată exclusiv și constitutiv la niveluri scăzute pe suprafața bazofilelor și mastocitelor, iar expresia sa crește odată cu activarea celulară. Markerii de activare a bazofilelor par să formeze două grupuri distincte de markeri care sunt reglați concomitent: unul care include CD63, CD107a și CD107b și altul care include CD203c, CD13 și CD164 . CD63 și CD203c sunt cei mai frecvent utilizați markeri de activare a bazofilelor.

Procedura de laborator a BAT constă în trei etape: stimularea celulară, colorarea celulelor și citometria de flux-Fig. 1. Sângele trebuie să fie procesat cât mai curând posibil după recoltarea sângelui, deoarece bazofilele își pierd viabilitatea și reactivitatea în timp. Cu toate acestea, au fost efectuate studii cu probe păstrate la +4 °C până la 24 h . Pentru BAT este necesar un volum mic de sânge (c.a. 1-2 ml, în funcție de numărul de condiții). Pentru stimularea celulară se pot utiliza extracte de alergen brut sau alergeni purificați sau recombinanți. Trebuie utilizate diferite concentrații de alergen, deoarece sensibilitatea bazofilelor la stimularea alergenului specific variază în funcție de pacienți.

Rezultatele BAT pot fi determinate în termeni de procent de bazofile care exprimă markerul de activare definit sau în termeni de intensitate medie a fluorescenței (MFI) prin calcularea indicelui de stimulare, adică raportul dintre MFI al condiției selectate și MFI al controlului negativ. Prima variantă este utilizată de obicei pentru CD63, deoarece CD63 nu este exprimat în celulele în repaus, iar expresia sa după activare este bimodală. Cel de-al doilea este utilizat de obicei pentru CD203c care este deja exprimat în celulele în repaus și creșterea sa în urma stimulării cu alergen este unimodală-Fig. 2.

La pacienții alergici, activarea bazofilelor indusă de alergeni are de obicei ca rezultat o curbă doză-răspuns în formă de clopot, cu concentrații crescânde ale alergenului (de obicei 5-6 diferențe logaritmice) care conduc la o creștere progresivă a expresiei markerilor de activare a bazofilelor până la atingerea unui platou-Fig. 3.

Există un grad mare de variabilitate în răspunsul bazofilelor la alergen între indivizi. Pentru a exprima această eterogenitate și pentru a compara răspunsurile bazofilelor între diferiți pacienți, pot fi determinați diverși parametri pe baza curbei doză-răspuns, cum ar fi CD-max și EC50 (50 % concentrație efectivă) sau CDens. CD-max este activarea maximă și corespunde proporției maxime de bazofile activate la orice concentrație de alergen . EC50 este doza eficientă la 50 % din activarea maximă și poate fi reprezentată, de asemenea, prin CDens. Descrisă pentru prima dată de Johansson , CDsens este inversul concentrației efective semimaximale, adică concentrația la care activarea bazofilelor reprezintă jumătate din activarea maximă, înmulțită cu 100 și poate fi calculată cu ajutorul formulei: CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax și CDsens sunt măsuri ale reactivității și, respectiv, ale sensibilității bazofilelor. Reactivitatea bazofilelor poate fi definită ca fiind gradul de activare a bazofilelor, adică proporția de bazofile activate, și poate fi, de asemenea, măsurată ca procent de bazofile CD63-pozitive la diferite concentrații de alergen sau ca raport al procentului de CD63-pozitive după stimularea cu alergen și cu anti-IgE. Sensibilitatea bazofilelor se referă la concentrația de alergen la care se activează bazofilele și poate fi exprimată ca procent din doza eficientă maximă (de exemplu, EC5, EC10), în afară de EC50 și CDens, menționate anterior. Figura 3 reprezintă răspunsul bazofililor la doi indivizi diferiți, unul cu reactivitate și sensibilitate mai mare a bazofilelor (albastru) și celălalt cu reactivitate și sensibilitate mai mică a bazofilelor (roșu), adică cu o proporție mai mică de bazofile care se activează ca răspuns la concentrații mai mari de alergen. Shreffler și Patil au propus un parametru nou pentru a măsura răspunsurile bazofilelor, aria de sub curba doză-răspuns, care are avantajul de a combina reactivitatea bazofilelor și sensibilitatea bazofilelor.

Utilizarea testului de activare a bazofilelor pentru diagnosticarea alergiilor alimentare

Într-un studiu publicat recent , am evaluat utilitatea BAT pentru a diagnostica alergia la arahide într-o populație bine caracterizată de copii alergici la arahide, sensibilizați și nesensibilizați la arahide. BAT a arătat o acuratețe ridicată (97 %) în diagnosticarea alergiei la arahide și a permis o reducere a numărului de OFC necesare cu 66 %. Am validat cut-off-urile de diagnosticare într-o populație recrutată în mod prospectiv și independent, iar performanța de diagnosticare a BAT a fost în continuare foarte bună în această a doua populație de studiu. În ultimii ani, alte studii au evaluat performanța BAT în diagnosticarea alergiilor la diferite alimente, inclusiv la arahide, lapte de vacă, ouă, grâu, alune, crustacee și piersici, precum și în diagnosticarea sindroamelor polen-aliment -Tabelul 1. Rapoarte de caz și serii mici de cazuri au sugerat că BAT poate fi, de asemenea, utilă pentru diagnosticarea alergiei la susan și la elicitori mai puțin comuni ai reacțiilor alergice alimentare mediate de IgE, cum ar fi orezul și galacto-oligozaharidele cu lanț scurt prezente în prebiotice . Un document de poziție publicat recent de Academia Europeană de Alergologie și Imunologie Clinică trece în revistă aplicațiile clinice ale BAT .

Diferiți factori pot influența performanța de diagnosticare și valorile cut-off ale BAT în diferite studii, unii legați de populația studiată, unii legați de designul studiului, unii legați de procedura de laborator și de metodologia adoptată pentru analizele de date-Tabel 2. Studiile existente sunt eterogene în majoritatea acestor aspecte, ceea ce limitează comparabilitatea lor și o aplicare mai largă a cut-off-urilor de diagnosticare determinate în studii specifice. Criteriul de diagnosticare a fiecărei alergii alimentare este specific fiecărui alergen, iar acuratețea diagnosticului poate să nu fie aceeași pentru alergeni diferiți. În plus, cut-off-urile definite la o populație nu sunt neapărat direct transferabile la o altă populație dintr-o altă locație geografică, evaluată într-un alt centru de alergii. O limitare a BAT este reprezentată de faptul că o mică parte dintre pacienții testați au bazofile care nu răspund (adică bazofile care răspund la un control pozitiv neimplicat de IgE, dar nu și la stimulenți implicați de IgE) și, prin urmare, au un rezultat neinterpretabil pentru acest test. Provocări suplimentare în transpunerea BAT de la o metodă de cercetare la un test de diagnostic în clinică sunt legate de standardizarea testului și de reproductibilitatea acestuia, precum și de raportul cost-eficiență al includerii BAT în abordarea de diagnosticare a pacienților cu suspiciune de alergie alimentară. Aceste aspecte nu au fost încă stabilite și necesită cercetări suplimentare.

Metodologia adoptată pentru efectuarea procedurii de laborator și pentru analiza datelor de citometrie în flux poate avea un impact semnificativ asupra rezultatelor obținute pentru BAT și, în consecință, în acuratețea sa diagnostică. De exemplu, identificarea bazofilelor cu ajutorul unui anticorp anti-IgE poate activa celulele și poate modifica rezultatele obținute cu o altă metodă de identificare a bazofilelor. Expresia anumitor markeri de identificare a bazofilelor, cum ar fi CCR3 și CD123, se poate modifica în urma activării bazofilelor. Într-un studiu recent, am descris faptul că, la aproximativ un sfert dintre pacienți, expresia CD123, detectată prin citometrie în flux, poate fi redusă în urma activării bazofilelor și, prin urmare, poate duce la o pierdere semnificativă a numărului de celule activate, utilizând metode care se bazează pe acest marker pentru identificarea bazofilelor. Acest lucru ar putea duce la o creștere a numărului de diagnostice greșite, în special fals-negative, cu consecințe importante pentru pacienții individuali. Adăugarea markerului CD203c specific bazofilelor la strategia de gating a păstrat numărul de celule și a permis reducerea numărului de rezultate fals-negative (de la 5 la 1 %). Strategia de gating modificată a îmbunătățit atât sensibilitatea (de la 88 % la 98 %), cât și specificitatea (de la 94 % la 96 %) a BAT, ceea ce a dus la o îmbunătățire generală a acurateței BAT pentru diagnosticarea alergiei la arahide de la 91 % la 97 %-Fig. 4. Pentru a realiza și interpreta BAT cu succes, „diavolul stă în detalii”; prin urmare, este foarte important să se analizeze cu atenție aspectele metodologice ale BAT.

În general, ca test de diagnostic, BAT a demonstrat o specificitate și o valoare predictivă pozitivă ridicată. Am validat cut-off-urile de diagnosticare determinate pentru alergia la arahide într-o populație independentă recrutată prospectiv, iar specificitatea și valoarea predictivă pozitivă a BAT au atins 100 %. Specificitatea ridicată este un plus important față de testele de alergie existente, cum ar fi SPT și sIgE, care au o sensibilitate ridicată, dar nu sunt foarte specifice. Specificitatea ridicată implică faptul că un BAT pozitiv confirmă cu încredere diagnosticul de alergie alimentară, dar un BAT negativ nu exclude neapărat diagnosticul. În funcție de raportul cost-beneficiu și de aspectele legate de siguranță, OFC poate fi efectuată la pacienții la care BAT oferă un rezultat neconcludent (și anume pacienții cu bazofile neresponsive) sau la pacienții la care BAT oferă un rezultat neconcludent și la pacienții la care BAT a fost negativ.

Abordarea pentru a decide cu privire la necesitatea OFC după BAT depinde, de asemenea, de modul în care rezultatul BAT este considerat în contextul rezultatelor altor teste de alergie, fie în combinație, când toate rezultatele disponibile sunt luate în considerare simultan, fie secvențial, când BAT este efectuată numai la pacienții care au avut rezultate echivoce sau discordante pentru celelalte teste de alergie. În studiul nostru anterior citat privind arahidele , am comparat performanța BAT cu cea a altor teste de alergie efectuate în paralel. BAT a avut performanțe mai bune decât SPT, IgE specific pentru arahide și IgE specific pentru Ara h 2 și alte componente ale arahidelor. Luând în considerare testele individuale, cel mai precis test de diagnosticare a fost BAT. Pentru a valorifica la maximum informațiile disponibile, rezultatele BAT pot fi utilizate în combinație cu rezultatele altor teste . Cu toate acestea, în general, cu cât se utilizează mai multe teste, cu atât mai mare este incertitudinea de diagnosticare (și cu atât mai mare este numărul de OFC), având în vedere că diferite teste pot furniza rezultate contradictorii . Mai bine decât combinarea simultană a rezultatelor testelor de alergie ar putea fi utilizarea BAT în mod secvențial în diagnosticarea alergiilor alimentare, la pacienții care au avut un rezultat neconcludent la celelalte teste de alergie . Această abordare poate fi avantajoasă și din punct de vedere al fezabilității, având în vedere aspectele practice implicate în efectuarea BAT, și anume nevoia de sânge proaspăt și resursele și expertiza tehnică necesare. Nu ar fi practic sau chiar necesar să se efectueze BAT la toți pacienții care sunt investigați pentru suspiciunea de alergie alimentară. BAT poate fi rezervată pentru cazuri selectate, în special pentru cazurile în care nu există antecedente de expunere orală la alimente sau în care istoricul clinic este neclar, iar rezultatele SPT și IgE specifice nu sunt concludente . BAT ar putea fi utilizat ca o a doua etapă în procesul de diagnosticare, după anamneza clinică și SPT și/sau IgE specifică, în cazurile dificile, înainte de a decide dacă este necesar un OFC -Fig. 5. Acuratețea diagnosticului și superioritatea BAT față de skin prick test și IgE specifice trebuie evaluate cu alți alergeni și în alte contexte clinice.

Pe lângă faptul că distinge pacienții alergici la alimente de cei toleranți la alimente, rezultatele BAT pot oferi informații suplimentare despre caracteristicile reacțiilor induse de alimente care pot fi utile în managementul pacienților alergici . S-a demonstrat că diferiți parametri ai BAT reflectă diferite caracteristici ale reacțiilor alergice, proporția de bazofile activate (reactivitatea bazofilelor) reflectând severitatea simptomelor alergice, iar doza la care bazofilele reacționează la alergen in vitro (sensibilitatea bazofilelor) reflectând doza de proteină alimentară la care pacienții au reacționat în timpul OFC . Aceste constatări în cazul alergiei la arahide au fost reproduse într-un studiu publicat ulterior și pot fi aplicabile la alte alergii alimentare. În orice caz, rezultatul BAT trebuie luat în considerare în contextul altor caracteristici clinice și factori de risc pentru gravitate, atunci când se evaluează pacienții cu alergii alimentare.

Utilizarea testului de activare a bazofilelor pentru monitorizarea dobândirii toleranței la alimente și a răspunsului clinic la tratamentele imunomodulatoare pentru alergia alimentară

Reflectând îndeaproape fenotipul clinic al pacienților alergici și toleranți, BAT poate fi util în evaluarea rezolvării naturale a alergiilor alimentare care sunt de obicei depășite în timp, cum ar fi alergiile la laptele de vacă , la ouă și la grâu, și în determinarea momentului în care pacienții trebuie să fie provocați din nou pentru a evalua dacă alimentul respectiv poate fi reintrodus în alimentație. BAT a demonstrat că distinge diferite fenotipuri de pacienți cu alergii la laptele de vacă și la ouă, și anume pacienți care tolerează formele extrem de încălzite ale acestor alimente, reacționând în continuare la alimentele neîncălzite, de pacienți care reacționează atât la laptele sau oul încălzit, cât și la laptele sau oul neîncălzit.

BAT a fost, de asemenea, utilizat pentru a monitoriza răspunsul clinic la tratamentele imunomodulatoare pentru alergii alimentare în cadrul studiilor de cercetare. În general, în studiile de imunoterapie pentru alimente precum arahidele , laptele de vacă și oul , BAT a arătat o scădere a reactivității bazofilelor la alergenii alimentari respectivi odată cu tratamentul, care este deosebit de evidentă la concentrațiile mai mici ale alergenului, reflectând scăderea sensibilității bazofilelor. În mod interesant, Thyagarajan et al. au arătat că, în timpul OIT la arahide, reducerea activării bazofilelor nu se producea numai ca răspuns la arahide, ci și la alergenul de ouă (la pacienții alergici la ouă) și la anti-IgE, dar nu și la controlul pozitiv neimediat de IgE, fMLP (formil-metionil-leucil-fenilalanină), sugerând că calea din aval de receptorul IgE a devenit anergică. Într-un studiu cu omalizumab la pacienții alergici la arahide , expresia CD203c în BAT a scăzut în timpul tratamentului și a revenit la nivelurile anterioare tratamentului după încetarea acestei terapii. În cele din urmă, medicamentul pe bază de plante chinezești FAHF-2 a arătat, de asemenea, un efect inhibitor semnificativ în răspunsul bazofililor la pacienții cu alergie la diferite alimente, în paralel cu ameliorarea clinică.

Consumate, aceste studii ilustrează faptul că BAT poate fi repetat la aceiași pacienți de-a lungul timpului pentru a evalua modificările răspunsului imunitar la alergeni alimentari cu un anumit tip de intervenție, fie că este vorba de imunoterapie orală, imunoterapie sublinguală, omalizumab sau alte strategii terapeutice sau preventive imunomodulatoare.

Perspective viitoare

În vederea aplicării BAT la diagnosticul de alergie alimentară în practica clinică, sunt necesare cercetări suplimentare pentru a defini și valida cut-off-urile de diagnostic pentru alergeni specifici și la diferite populații de pacienți. Standardizarea procedurilor de laborator ar fi importantă pentru a permite comparabilitatea rezultatelor BAT între centre. Acest lucru ar necesita standardizarea protocolului pentru testul in vitro și a metodelor de citometrie în flux și de analiză a datelor. Utilizarea unei metodologii similare pentru BAT ar permite compararea rezultatelor BAT în diferite centre, atât în scopuri clinice, cât și în scopuri de cercetare, inclusiv în cadrul studiilor multicentrice.

După ce va fi validat în mod corespunzător pentru diagnosticarea alergiilor alimentare specifice, BAT poate fi utilizat pentru a monitoriza răspunsul clinic la tratamentele imunomodulatoare, cum ar fi imunoterapia specifică alergenului și produsele biologice. BAT are, de asemenea, un potențial enorm pentru studii mecaniciste pentru a ne îmbunătăți înțelegerea rolului bazofilelor în mecanismele imunitare ale alergiilor alimentare și ale toleranței alimentare.

.