U.S. Food and Drug Administration

Iulie 2000

Principii toxicologice pentru evaluarea siguranței ingredientelor alimentareRedbook 2000Capitolul IV.C.1.d. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test

Return to Redbook 2000 table of contents

I. Introducere

Micronucleii sunt corpuri citoplasmatice care conțin cromatină și care se formează atunci când fragmente de cromozomi acentrici sau cromozomi întârzie în timpul anafazei și nu reușesc să fie încorporați în nucleele celulelor fiice în timpul diviziunii celulare. Deoarece leziunile genetice care au ca rezultat rupturi cromozomiale, cromozomi anormali din punct de vedere structural sau anomalii ale fusului conduc la formarea micronucleilor, incidența micronucleilor servește drept indice al acestor tipuri de leziuni. S-a stabilit că, în esență, toți agenții care provoacă rupturi cromozomiale de două șiruri (clastogeni) induc micronuclee. Deoarece numărarea micronucleilor este mult mai rapidă și mai puțin solicitantă din punct de vedere tehnic decât marcarea aberațiilor cromozomiale și deoarece micronucleii rezultă din două tipuri importante de leziuni genetice (clastogeneza și întreruperea fusului), testul micronucleului a fost utilizat pe scară largă pentru depistarea substanțelor chimice care provoacă aceste tipuri de leziuni.

Acest ghid se referă la cel mai utilizat test in vivo al micronucleului in vivo: testul micronucleului în eritrocitele de mamifere. Acest test de micronucleu in vivo este utilizat pentru detectarea leziunilor induse de substanța de testat la nivelul cromozomilor sau al aparatului mitotic al eritroblastelor prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă și/sau din celulele sanguine periferice ale animalelor, de obicei rozătoare.

Scopul testului micronucleului este de a identifica substanțele care provoacă leziuni citogenetice care au ca rezultat formarea de micronuclee care conțin fragmente cromozomiale întârziate sau cromozomi întregi.

Când un eritroblast de măduvă osoasă se transformă într-un eritrocit policromat, nucleul principal este extrudat; micronuclee care s-au format pot rămâne în citoplasma altfel enucleată. Vizualizarea micronuclei este facilitată în aceste celule cu ajutorul unor tehnici de colorare specifice și pentru că acestea nu au un nucleu principal. O creștere a frecvenței eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate este un indiciu al leziunilor cromozomiale induse.

II. Definiții

Centromerul (Kinetochore) este o regiune (regiuni) a unui cromozom cu care se asociază fibrele fusiforme în timpul diviziunii celulare, permițând deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice.

Micronucleii sunt nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor și suplimentare față de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meiozei) de fragmente cromozomiale rămase în urmă sau de cromozomi întregi.

Eritrocitele normocromatice sunt eritrocite mature care sunt lipsite de ribozomi și pot fi distinse de eritrocitele imature, policromatice, prin colorații selective pentru ribozomi.

Eritrocitele policromatice sunt eritrocite imature, aflate într-un stadiu intermediar de dezvoltare, care conțin încă ribozomi și, prin urmare, pot fi distinse de eritrocitele mature, normocromatice, prin colorații selective pentru ribozomi.

III. Considerații inițiale

Măduva osoasă a rozătoarelor este utilizată în mod curent în acest test, deoarece în acest țesut se produc eritrocite policromatice. Măsurarea eritrocitelor imature (policromatice) micronucleate din sângele periferic este la fel de acceptabilă la orice specie la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care a demonstrat o sensibilitate adecvată pentru a detecta agenții care provoacă aberații cromozomiale structurale și/sau numerice. Micronucleii pot fi deosebiți după o serie de criterii. Printre acestea se numără identificarea prezenței sau absenței unui kinetocoroid sau a ADN centromeric în micronuclee. Frecvența eritrocitelor imature (policromatice) micronucleate este principalul criteriu de evaluare. Numărul de eritrocite mature (normocromatice) din sângele periferic care conțin micronuclee dintr-un anumit număr de eritrocite mature poate fi, de asemenea, utilizat ca parametru final al testului atunci când animalele sunt tratate în mod continuu pentru o perioadă care depășește durata de viață a eritrocitelor la specia luată în considerare (de exemplu, 4 săptămâni la șoarece), cu condiția să nu aibă loc o selecție splenică semnificativă împotriva eritrocitelor micronucleate la specia/străina respectivă. Consecințele selecției splenice, în cazul în care are loc, ar trebui abordate pe deplin.

Acest test de micronucleare in vivo la mamifere este deosebit de relevant pentru evaluarea riscului mutagen, deoarece permite luarea în considerare a factorilor de metabolism in vivo, a farmacocineticii și a proceselor de reparare a ADN-ului, deși aceștia pot varia în funcție de specie, de țesut și de parametrii genetici. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru investigarea suplimentară a unui efect mutagen detectat de un sistem in vitro.

Dacă există dovezi că substanța de testat sau un metabolit reactiv nu va ajunge la țesutul țintă, nu este adecvat să se utilizeze acest test.

IV. Principiul metodei de testare

Animalele sunt expuse la substanța de testare pe o cale adecvată. Dacă se utilizează măduva osoasă, animalele sunt sacrificate la momente adecvate după tratament, se extrage măduva osoasă, se fac și se colorează preparatele.(16),(17),(18),(26),(32),(41) În cazul în care se utilizează sânge periferic, sângele se recoltează la momente adecvate după tratament și se fac și se colorează preparate de frotiuri.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) Se analizează preparatele pentru a se detecta prezența micronucleilor.

V. Descrierea metodei

A. Preparate

1. Selectarea speciilor de animale

Istoric, șoarecii sau șobolanii au fost utilizați în mod obișnuit pentru acest test. În cazul în care măduva osoasă este țesutul prelevat, se poate utiliza orice specie de mamifere adecvată (a se vedea secțiunea III. de mai sus). Ca în cazul oricărui studiu toxicologic, selectarea speciei adecvate trebuie justificată. În cazul în care se utilizează sânge periferic, se recomandă șoarecii. Cu toate acestea, se poate folosi orice specie de mamifere adecvată, cu condiția să fie o specie la care splina nu elimină eritrocitele micronucleate sau o specie care a demonstrat o sensibilitate adecvată pentru detectarea agenților care provoacă aberații cromozomiale structurale și/sau numerice. Ar trebui să se utilizeze tulpini de laborator de animale tinere ș i sănătoase utilizate în mod obișnuit. La începutul studiului, variația de greutate a animalelor ar trebui să fie minimă și să nu depășească ±20% din greutatea medie a fiecărui sex.

2. Condiții de adăpostire și de hrănire

Temperatura din camera animalelor de laborator ar trebui să fie adecvată pentru speciile utilizate; pentru șoareci și șobolani, aceasta ar trebui să fie de 22°C (±3°C). Deși umiditatea relativă ar trebui să fie de cel puțin 30% și, de preferință, să nu depășească 70%, cu excepția perioadei de curățare a camerei, obiectivul ar trebui să fie de 50-60%. Iluminatul ar trebui să fie artificial, cu o secvență de 12 ore de lumină și 12 ore de întuneric. Pentru hrănire, se pot folosi diete convenționale de laborator și o cantitate nelimitată de apă potabilă. Alegerea dietei poate fi influențată de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al unei substanțe de testare atunci când este administrată pe această cale. Animalele pot fi adăpostite individual sau în cuști în grupuri mici de același sex.

3. Pregătirea animalelor

Animalele tinere adulte sănătoase trebuie repartizate aleatoriu în grupurile de control și de tratament. Animalele ar trebui să fie identificate în mod unic. Animalele ar trebui să fie aclimatizate la condițiile de laborator timp de cel puțin cinci zile. Cuștile trebuie aranjate astfel încât posibilele efecte datorate amplasării în cușcă să fie reduse la minimum.

4. Pregătirea dozelor

Substanțele de testare solide trebuie dizolvate sau suspendate în solvenți sau vehicule adecvate și diluate, dacă este cazul, înainte de administrarea dozelor la animale. Substanțele de testare lichide pot fi administrate direct sau diluate înainte de dozare. Trebuie utilizate preparate proaspete ale substanței de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează acceptabilitatea depozitării.

B. Condiții de testare

1. Solventul/vehiculul

Solventul/vehiculul nu trebuie să producă efecte toxice la nivelurile de doză utilizate și nu trebuie să fie suspectat de reacție chimică cu substanța de testat. În cazul în care se utilizează alți solvenți/vehicule decât cei utilizați în mod obișnuit, utilizarea acestora trebuie să fie susținută de date de referință care să indice compatibilitatea lor cu substanța de testat și cu animalele. Se recomandă ca, ori de câte ori este cazul, să se ia în considerare mai întâi utilizarea unui solvent/vehicul apos.

2. Controale

În general, ar trebui să se includă controale pozitive și negative (solvent/vehicul) concomitente pentru fiecare sex în fiecare test efectuat cu rozătoare. Cu toate acestea, atunci când testul micronucleului este efectuat ca parte a unui studiu de toxicitate generală în conformitate cu orientările BPL, atunci verificarea dozării adecvate se va realiza prin analiză chimică. În astfel de cazuri, tratamentul concomitent al animalelor cu un agent de control pozitiv poate să nu fie necesar, iar controlul procedurilor de colorare și de notare poate fi realizat prin includerea unor eșantioane de referință adecvate obținute anterior de la animale care nu fac parte din experimentul actual. În studiile cu specii superioare, cum ar fi primatele sau câinii, se pot omite controalele pozitive, cu condiția ca laboratorul de testare să fi demonstrat anterior un răspuns acceptabil la substanțele de control pozitiv ale speciei utilizate. În toate cazurile, controalele negative concomitente reprezintă o componentă obligatorie a studiului. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din grupurile de control ar trebui să fie manipulate într-un mod identic cu animalele din grupurile de tratament.

Controalele pozitive ar trebui să producă micronuclee in vivo la niveluri de expunere care se așteaptă să dea o creștere detectabilă și semnificativă din punct de vedere statistic față de fondul de bază. Dozele de control pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât efectele să fie clare, dar să nu dezvăluie imediat cititorului identitatea lamelelor codificate. Este acceptabil ca martorul pozitiv să fie administrat pe o cale diferită de cea a substanței de testat ș i să fie prelevat doar o singură dată. În plus, se poate lua în considerare utilizarea unor substanțe chimice de control pozitiv legate de clasa chimică, dacă sunt disponibile. Exemple de substanțe de control pozitiv includ:

Animale martor negative, tratate numai cu solvent sau cu vehicul și tratate în alt mod în același mod ca și grupurile de tratament, ar trebui să fie incluse pentru fiecare moment de prelevare, cu excepția faptului că, în circumstanțe adecvate, poate fi posibilă utilizarea unui animal ca martor propriu prin compararea eșantioanelor de dinainte de tratament și de după tratament. În cazul în care se aplică o singură prelevare de probe pentru controalele negative, trebuie să se justifice momentul de prelevare ales. În plus, ar trebui să se utilizeze, de asemenea, martori netratați, cu excepția cazului în care există (a) date disponibile de la laboratorul de testare sau (b) date de control istorice sau publicate care să demonstreze că solventul/vehiculul ales nu induce efecte nocive sau mutagene.

Dacă se utilizează sânge periferic, o probă de dinaintea tratamentului poate fi, de asemenea, acceptabilă ca martor negativ concomitent, dar numai în studiile de scurtă durată cu sânge periferic (de ex, 1-3 tratament(e)) atunci când datele rezultate se încadrează în intervalul așteptat pentru controlul istoric și când a fost demonstrată absența unui efect de solvent.

VI. Procedura pentru șobolani și șoareci

Secțiunile următoare oferă îndrumări pentru procedurile la șoareci și șobolani, speciile utilizate cel mai frecvent în acest test.

A. Numărul și sexul animalelor

Care grup tratat și de control trebuie să includă cel puțin 5 animale analizabile pentru fiecare sex(12).(12) Dacă la momentul studiului există date disponibile din studii efectuate la aceeași specie și utilizând aceeași cale de expunere care demonstrează că nu există diferențe substanțiale între sexe în ceea ce privește toxicitatea, atunci testarea la un singur sex va fi suficientă.

B. Program de tratament

Se pot recomanda mai multe programe de tratament diferite (de exemplu, 1, 2 sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore). Probele provenite din regimuri cu doze extinse sunt acceptabile atâta timp cât s-a demonstrat un efect pozitiv pentru acest studiu sau, pentru un studiu negativ, atâta timp cât s-a demonstrat toxicitatea sau s-a utilizat doza limită (a se vedea secțiunea „D”, de mai jos) și s-a continuat administrarea dozei până la momentul prelevării. Acest lucru se bazează pe studii care arată că expunerile repetate ale șoarecilor și șobolanilor de până la o durată subcronică au produs efecte de o magnitudine similară cu cele obținute cu testul acut tradițional.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) Cu toate acestea, deoarece există o oarecare îngrijorare că sensibilitatea ar putea fi redusă în studiile pe termen mai lung din cauza eșecului de a atinge o MTD reală sau din cauza faptului că ar putea avea loc o adaptare, în prezent se consideră că durata tratamentului ar trebui limitată la patru săptămâni până când sensibilitatea testului este confirmată atunci când se utilizează tratamente mai lungi.(12)

Substanțele de testat pot fi, de asemenea, administrate sub formă de doză fracționată, și anume, două sau mai multe tratamente în aceeași zi, separate de cel mult câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material sau pentru a minimiza fluctuațiile nivelurilor sanguine ale articolului de testat.

Două moduri în care se poate efectua testul sunt:

• Animalele sunt tratate cu substanța de testat o dată sau de două ori la un interval de cel mult 24 de ore. Se prelevează probe de măduvă osoasă de cel puțin două ori între 24 și 48 de ore după ultima doză, cu un interval (intervale) adecvat(e) între probe. Utilizarea unor momente de prelevare de probe mai devreme de 24 de ore de la tratament trebuie justificată. Probele de sânge periferic se prelevează de cel puțin două ori între 36 și 72 de ore de la ultimul tratament, cu un interval (intervale) adecvat(e) între probe. În cazul în care se recunoaște un răspuns pozitiv la un moment de prelevare, nu este necesară o prelevare suplimentară.
• În cazul în care se utilizează trei sau mai multe tratamente zilnice (de exemplu, trei sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore), probele pot fi prelevate o dată la cel mult 24 de ore de la ultimul tratament pentru măduva osoasă și o dată la cel mult 40 de ore de la ultimul tratament pentru sângele periferic(12), (20)

Se pot utiliza momente suplimentare de prelevare a probelor, atunci când este relevant și justificat din punct de vedere științific.

C. Niveluri de doză

Dacă se efectuează un studiu de constatare a intervalului de doză, deoarece nu există date adecvate disponibile, acesta trebuie efectuat în același laborator, folosind aceleași specii, tulpini, sex și regim de tratament care urmează să fie utilizate în studiul principal.(7) Dacă există toxicitate, trebuie utilizate trei niveluri de doză pentru primul timp de prelevare. Aceste niveluri de doză ar trebui să acopere o gamă de la o toxicitate clară la o toxicitate mică sau inexistentă. La timpul de eșantionare ulterior, trebuie utilizată doar cea mai mare doză. Doza cea mai mare este definită ca fiind doza care produce semne de toxicitate astfel încât niveluri de doză mai mari, bazate pe același regim de dozare, ar trebui să producă letalitate. Substanțele cu activități biologice specifice la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii și mitogenii) pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și trebuie evaluate de la caz la caz. Doza cea mai mare poate fi, de asemenea, definită ca o doză care produce un anumit indiciu de toxicitate a măduvei osoase (de exemplu, o reducere a proporției de eritrocite imature din totalul eritrocitelor din măduva osoasă sau din sângele periferic).

D. Testul limită

Dacă nu rezultă efecte toxice observabile în urma unui singur tratament cu un nivel de doză de cel puțin 2000 mg/kg greutate corporală sau în urma a două tratamente în aceeași zi și dacă genotoxicitatea nu ar fi de așteptat pe baza datelor provenite de la substanțe înrudite din punct de vedere structural, este posibil să nu fie necesar un studiu complet care să utilizeze 3 niveluri de doză. Pentru studiile de o durată mai lungă, doza limită este de 2000 mg/kg/greutate corporală/zi pentru un tratament de până la 14 zile și de 1000 mg/kg/greutate corporală/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. Expunerea umană preconizată poate indica necesitatea utilizării unui nivel de doză mai mare în testul limită.

E. Administrarea dozelor

Substanța de testat se administrează, de obicei, prin gavare cu ajutorul unei sonde gastrice sau a unei canule de intubație adecvate, sau prin injecție intraperitoneală. Alte căi de expunere pot fi acceptabile în cazul în care acestea pot fi justificate. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat prin gavare sau injectare în același timp depinde de mărimea animalului de testat. Volumul nu trebuie să depășească 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât acestea trebuie să fie justificată. Cu excepția substanțelor iritante sau corozive, care, în mod normal, vor dezvălui efecte exacerbate la concentrații mai mari, variabilitatea volumului de testare trebuie să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației pentru a asigura un volum constant la toate nivelurile de doză.

F. Pregătirea măduvei osoase/sângelui

Celulele de măduvă osoasă se obțin de obicei din femur sau tibie imediat după sacrificare. În mod obișnuit, celulele sunt prelevate din femururi sau tibii, pregătite și colorate folosind metode stabilite. Sângele periferic se obține din vena cozii sau dintr-un alt vas de sânge adecvat. Celulele sanguine se colorează imediat în mod supravital(4),(5),(14) sau se fac preparate de frotiuri și apoi se colorează. Utilizarea unui colorant specific ADN-ului (de exemplu, portocaliu de acridină(15) sau Hoechst 33258 plus pironină-Y(30)) poate elimina unele dintre artefactele asociate cu utilizarea unui colorant nespecific ADN-ului. Acest avantaj nu exclude utilizarea coloranților convenționali (de exemplu, Giemsa). Sisteme suplimentare (de ex, coloane de celuloză pentru îndepărtarea celulelor nucleate(36)) pot fi, de asemenea, utilizate, cu condiția ca aceste sisteme să se fi dovedit a funcționa în mod adecvat pentru prepararea micronucleilor în laborator.

G. Analiză

Proporția de eritrocite imature din totalul eritrocitelor (imature + mature) se determină pentru fiecare animal prin numărarea unui total de cel puțin 200 de eritrocite pentru măduva osoasă și 1000 de eritrocite pentru sângele periferic.(9) Toate lamelele, inclusiv cele ale martorilor pozitivi și negativi, trebuie să fie codificate independent înainte de analiza microscopică. Cel puțin 2 000 de eritrocite imature per animal sunt punctate pentru a se stabili incidența eritrocitelor imature micronucleate. Se pot obține informații suplimentare prin marcarea eritrocitelor mature pentru micronuclee. Atunci când se analizează lamele, proporția de eritrocite imature din totalul eritrocitelor nu trebuie să fie mai mică de 20 % din valoarea de control. În cazul în care animalele sunt tratate în mod continuu timp de 4 săptămâni sau mai mult, cel puțin 2000 de eritrocite mature pe animal pot fi, de asemenea, marcate pentru incidența micronuclei. Sistemele de analiză automatizată (analiza de imagine sau analiza citometrică în flux a suspensiilor de celule) sunt alternative acceptabile la evaluarea manuală, dacă sunt justificate și validate în mod corespunzător în raport cu notarea microscopică clasică.(12)

VII. Procedura pentru alte specii decât șobolanii și șoarecii

Informații publicate pe baza studiilor efectuate pe șoareci, șobolani, hamsteri, porci, câini, primate neumane și oameni(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) indică faptul că frecvența spontană și cea indusă a eritrocitelor micronucleate este similară la majoritatea speciilor de mamifere și sugerează că măsurarea incidenței eritrocitelor imature micronucleate din măduva osoasă este adecvată pentru evaluarea leziunilor cromozomiale sau fusiforme la speciile studiate până în prezent. Apariția și dispariția eritrocitelor micronucleate în măduva osoasă depinde de cinetica eritrogenezei și de durata de viață a eritrocitelor la fiecare specie și, prin urmare, regimurile de dozare și de prelevare a probelor trebuie modificate în conformitate cu parametrii corespunzători ai cineticii eritrocitare pentru fiecare specie. Alte specii decât șoarecii sau șobolanii pot fi utilizate, dacă este cazul, dar trebuie incluse următoarele informații:

• Justificarea speciei selectate și a schemelor de dozare și de prelevare a probelor utilizate în raport cu cinetica eritropoiezei și cu durata de viață a eritrocitelor la speciile utilizate;
• Dovada că frecvența micronucleilor spontani este în concordanță cu informațiile publicate și/sau în concordanță în cadrul laboratorului care efectuează studiul;
• Evidența faptului că genotoxicanții cunoscuți produc o creștere a frecvenței micronucleilor la speciile utilizate, precum și valorile de referință pentru amploarea răspunsului indus;
• Impactul eliminării selective splenice a celulelor micronucleate din sângele periferic (atunci când acesta din urmă servește ca țesut monitorizat).

VIII. Date și raportare

A. Rezultatele tratamentului

Datele individuale ale animalelor trebuie să fie prezentate sub formă de tabel. Unitatea experimentală este animalul. Numărul de eritrocite imature marcate, numărul de eritrocite imature micronucleate și numărul de eritrocite imature din totalul eritrocitelor trebuie să fie enumerate separat pentru fiecare animal analizat. În cazul în care animalele sunt tratate în mod continuu timp de 4 săptămâni sau mai mult, datele privind eritrocitele mature trebuie, de asemenea, să fie prezentate, dacă sunt colectate. Proporția de imaturi din totalul eritrocitelor și, dacă se consideră că este cazul, procentul de eritrocite mature micronucleate trebuie să fie indicate pentru fiecare animal. Dacă nu există dovezi privind o diferență de răspuns între sexe, datele de la ambele sexe pot fi combinate pentru analiza statistică.

B. Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Există mai multe criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi o creștere legată de doză a numărului de celule micronucleate sau o creștere clară a numărului de celule micronucleate într-un singur grup de doze la un singur moment de prelevare. Ar trebui să se utilizeze metode statistice pentru a evalua rezultatele testului.(24),(35) Criteriile statistice pentru un rezultat pozitiv, negativ sau echivoc ar trebui să fie menționate clar în protocol. Deoarece factorii biologici pot modifica interpretarea, semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a ajunge la o concluzie. Rezultatele echivoce ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, utilizând o modificare a condițiilor experimentale, dacă este cazul.

Deși majoritatea experimentelor vor da rezultate clar pozitive sau negative, în cazuri rare setul de date va împiedica formularea unei judecăți definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot rămâne echivoce sau îndoielnice indiferent de numărul de repetări ale experimentului.

Rezultatele pozitive la testul micronucleului indică faptul că o substanță induce micronuclee, care sunt rezultatul deteriorării cromozomiale sau al deteriorării aparatului mitotic în eritroblastele speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile de testare, substanța testată nu produce leziuni cromozomiale sau ale fusului care să conducă la formarea de micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate.

Ar trebui discutată probabilitatea ca substanța testată sau metaboliții acesteia să ajungă în circulația generală sau în mod specific în țesutul țintă (de exemplu, toxicitate sistemică). Demonstrarea unei expuneri adecvate a țesutului țintă într-un test negativ al micronucleului este un aspect deosebit de important atunci când există dovezi pozitive de genotoxicitate în unul sau mai multe alte sisteme de testare.

C. Raportul de testare

Raportul de testare trebuie să includă, de asemenea, următoarele informații:

1. Substanța de testare

• datele de identificare și nr. CAS.., dacă sunt cunoscute
• natură fizică și puritate
• proprietăți fizico-chimice relevante pentru desfășurarea studiului
• stabilitatea substanței de testat, dacă sunt cunoscute

2. Solvent/vehicul

• justificarea alegerii vehiculului
• solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă sunt cunoscute

3. Soluții de dozare

• orele la care au fost preparate și utilizate soluțiile de dozare (sau intervalul dintre preparare și utilizare), precum și condițiile de depozitare
• date care verifică concentrația soluției de dozare, dacă sunt disponibile

4. Animale de testare

• specii/stepe utilizate, inclusiv justificarea
• numărului, vârstei și sexului animalelor
• sursa, condițiile de adăpostire, regimul alimentar etc.
• greutatea individuală a animalelor la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate corporală, media și deviația standard pentru fiecare grup
• informații privind influența potențială a selecției splenice asupra incidenței celulelor micronucleate în sângele periferic, dacă este cazul

5. Condiții de testare

• date de control pozitive și negative (vehicul/solvent)
• date din studiul de determinare a intervalului de acțiune, dacă au fost efectuate
• raționament pentru selectarea nivelului de dozare
• detalii privind prepararea substanței de testare
• detalii privind administrarea substanței de testare
• raționament privind calea de administrare și regimul de dozare
• metode de verificare a faptului că substanța de testare a ajuns în circulația generală și/sau în țesutul țintă, dacă este cazul
• conversia din concentrația substanței de testat din dietă/apă de băut (ppm) în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul
• detalii privind calitatea alimentelor și a apei
• descrierea detaliată a programelor de tratament și de prelevare a probelor
• metode de preparare a lamelelor
• metode de măsurare a toxicității
• criterii de notare a eritrocitelor imature micronucleate și, dacă este cazul și aplicabil, eritrocitele mature
• numărul de celule analizate per animal
• criterii pentru considerarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau echivoce

6. Rezultate

• semne de toxicitate
• proporția de eritrocite imature din totalul eritrocitelor
• numărul de eritrocite imature micronucleate din totalul eritrocitelor imature, dat separat pentru fiecare animal
• dacă este cazul și aplicabil, numărul de eritrocite mature micronucleate din totalul eritrocitelor mature, se indică separat pentru fiecare animal
• media ± deviația standard a eritrocitelor imature micronucleate și, dacă este cazul, a eritrocitelor mature pe grup
• relația doză-răspuns, dacă este posibil
• analize statistice și justificarea metodei aplicate, cu citarea corespunzătoare a literaturii de specialitate
• date de control negativ curente și istorice
• date de control pozitiv curente și istorice

7. Discutarea rezultatelor

8. Concluzii

XI. Addendum: Identificarea micronucleilor derivați din fragmente acentrice vs. cromozomi centromerici

Micronucleii pot fi formați de fragmente acentrice sau de cromozomi întregi întârziați în mitoză. Aceștia din urmă micronuclei au fost recunoscuți pentru prima dată prin dimensiunea lor mare(49), prin C-banding(47) sau prin măsurarea conținutului de ADN(46).(46) Cu toate acestea, aceste metode nu erau foarte fiabile. Prin urmare, au fost dezvoltate două metode de citogenetică moleculară pentru a identifica prezența centromerilor în micronuclee și, astfel, pentru a face diferența între micronuclee de origine clastogenă și aneugenică:(12) 1) colorarea CREST-imunofluorescentă și 2) hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) cu sonde de ADN pancentromeric. Atunci când este important din punct de vedere mecanic să se determine prezența kinetocorului sau a centromerului în micronuclei, se pot aplica aceste metode.

Metoda CREST aplicată la testul micronucleului din măduva osoasă este descrisă în detaliu de Miller și Adler.(33) Celulele de pe lame (frotiuri normale de măduvă osoasă) sunt fixate, deshidratate, incubate în două etape cu SDS și Triton-X și apoi colorate cu anticorpi. ADN-ul este contracolorat cu Hoechst 33258.

Cu FISH, sonda ADN-satelit minor care se hibridizează în apropierea centromerului(43) este utilizată pentru a identifica regiunea centromerică, dacă este prezentă. O metodă pentru FISH cu sondele ADN centromerice a fost descrisă de Pinkel et al.(34) Această metodă poate fi aplicată eritrocitelor care conțin micronuclee sortate în flux(10) sau micronuclee izolate obținute din probe de sânge periferic.(13)

În lamelele de control, rata de micronuclee marcate care conțin regiunea centromerică este de aproximativ 50%.(43) Aproximativ 70% din micronuclee induse de aneugenii cunoscuți (colchicină și vinblastină) sunt marcate,(33) în timp ce cele induse de clastogeni (hidrochinonă și mitomicina C) prezintă doar 5-15% micronuclee marcate.(33) Pentru a caracteriza activitatea relativă clastogenă față de cea aneugenică a unei substanțe chimice, este util să se utilizeze ca indice numărul de eritrocite policromatice micronucleate la 1000 de eritrocite policromatice care conțin regiunea centromerică.(42)

Principala deficiență a metodelor FISH descrise până în prezent este că acestea nu fac diferența între eritrocitele normocromatice și cele policromatice.(12) Astfel, numai preparatele în care o mare parte din micronucleii prezenți sunt induși de articolul de testat sunt adecvate pentru analiză. De exemplu, probele de sânge periferic provenite din experimente cu expuneri acute la animale adulte nu sunt, în esență, niciodată adecvate pentru analiză, deoarece populația celulară țintă (eritrocite imature) reprezintă doar 3-5% din eritrocitele din probă.

În concluzie, marcarea CREST sau FISH sunt considerate metode fiabile de detectare a proprietăților aneugenice ale substanțelor chimice în testul micronucleului in vivo, cu condiția să se acorde atenție pentru a se asigura că sunt utilizate probe adecvate pentru analiză.(12) Cu toate acestea, complexitatea metodelor actuale limitează utilizarea lor la acele cazuri în care o substanță chimică este suspectată de a provoca afectarea fusului (de ex, din cauza prezenței micronuclei mari, a inducerii poliploidiei etc.) sau atunci când există alte motive specifice pentru a obține aceste informații mecaniciste.

X. Referințe

1. Armstrong, M.J., Galloway, S.M. (1993). Micronuclee induse în sângele periferic al șoarecilor transgenici mu-PIM-1 prin tratament oral cronic cu 2-Acetilaminofluoren sau benzen, dar nu cu dietilnitrozamină sau 1,2-dicloroetan. Mutation Res. 302:61-70.
2. Choy, W.N., MacGregor, J.T., Shelby, M.D., Maronpot, R.R. (1985). Inducerea de micronuclei de către benzen la șoarecii B6C3F1: Analiză retrospectivă a frotiurilor de sânge periferic de la NTP Carcinogenesis Bioassay. Mutation Res. 143:55-59.
3. Choy, W.N., Willhite, C.C., Cukierski, M.J. și Book, S.A. (1989). Studiul micronucleului de primat al L-Selenometioninei. Environ. Molec. Mutagenesis 14:123-125.
4. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS. Mutation Res. 278:83-98.
5. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recomandat pentru testul de micronucleu din sângele periferic de șoarece pe termen scurt. Mutagenesis 10:153-159.
6. Everson, R.B., Wehr, C.M., Erexson, G.L. și MacGregor, J.T. (1988). Asocierea depleției marginale de folat cu creșterea daunelor cromozomiale umane in vivo: Demonstrație prin analiza eritrocitelor micronucleate. J. Natl. Cancer Inst. 80:25-529.
7. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J., și Richold, M. (1992). Raport al grupului de lucru al Societății Britanice de Toxicologie/Societatea britanică de Mutageni de Mediu: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7:313-319.
8. Garriott M.L., Brunny J.D., Kindig D.E., Parton J.W., Schwier L.S. (1995). The In Vivo Rat Rat Micronucleus Test: Integration with a 14-Day Study. Mutation Res. 342:71-6.
9. Gollapudi, B. și McFadden, L.G. (1995). Dimensiunea eșantioanelor pentru estimarea raportului dintre eritrocitele policromatice și normocromatice în testul micronucleului din măduva osoasă. Mutation Res. 347:97-99).
10. Grawé J., Nüsse M. și Adler I.-D. (1997). Quantitative and Qualitative Studies of Micronucleus Induction in Mouse Erythrocytes Using Flow Cytometry: I. Măsurarea inducerii micronucleului în eritrocitele policromatice din sângele periferic de către substanțe chimice cu genotoxicitate cunoscută și suspectată. Mutagenesis 12:1-8.
11. Hamada, S., Sutou, S., Morita, T., Wakata, A., Asanami, S., Hosoya, S., Ozawa, S., Kondo, K., Nakajima, M., Shimada, H., Osawa, K., Kondo, Y., Asano, N., Sato, S.-I., Tamura, H., Yajima, N., Marshall, R., Moore, C., Blakey, D.H., Weaver, J.L., Torus, D.K., Proudlock, R., Ito, S., Namiki, C., Hayashi, M. (1999). Evaluarea testului de micronucleare pe termen lung la rozătoare: Summary of the 13th Collaborative Study by CSGMT/JEMS.MMS, Environ. Molec. Mutagenesis 37(2):93-110.
12. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Gatehouse, D.G., Adler, I.-D., Blakey, D.H., Dertinger, S.D., Krishna, G., Morita, T., Russo, A. și Sutou, S. (2000). In Vivo Rodent Erythrocyte Erythrocyte Micronucleus Assay: II. Some Aspects of Protocol Design Including Repeated Treatements, Integration with Toxicity Testing, and Automated Scoring. Environ. Molec. Mutagenesis 35: 234-252.
13. Hayashi M., Mäki-Paakkanen J., Tanabe H., Honma M., Suzuki T., Matsuoka A., Mizusawa H., Sofuni T. (1994). Izolarea micronucleilor din sângele de șoarece, hibridizarea in situ prin fluorescență cu o sondă de ADN centromeric de șoarece. Mutation Res. 307:245-251.
14. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T., și Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Research 245:245-249.
15. Hayashi, M., Sofuni, T., și Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120:241-247.
16. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. și Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res. 312:293-304.
17. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res. 18:187-190.
18. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. și Newell, G.W. (1983). Inducerea de micronuclei ca măsură a genotoxicității. Mutation Res. 123:61-118.
19. Henderson, L., Fedyk, J., Windebank, S., Smith, M. (1993). Inducerea de micronuclei în măduva osoasă și sângele periferic de șobolan în urma tratamentului acut și subcronic cu azatioprină. Mutation Res. 291:79-85.
20. Higashikuni, N. și Sutou, S. (1995). An Optimal, Generalized Sampling Time of 30 ±6 h After Double Doing in the Mouse Peripheral Blood Micronucleus Test. Mutagenesis 10:313-319.
21. Jauhar, P.P., Henika, P.R., MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Shelby, M.D., Murphy, S.A., Margolin, B.H. (1988). 1,3-Butadiena: Inducerea eritrocitelor micronucleate în sângele periferic al șoarecilor B6C3F1 expuși prin inhalare timp de 13 săptămâni. Mutation Res. 209:171-176.
22. Krishna, G., Criswell, K., Zielinski, D., Urda G., Juneau, P., Bleavins, M., Theiss, J., (1998a). Validarea evaluării micronucleului la șobolan cu ajutorul citometriei în flux cu cinci compuși model. Environ. Molec. Mutagen. 31:46.
23. Krishna, G., Urda, G., Theiss, J. (1998b). Principles and Practices of Integrating Genotoxicity Evaluation into Routine Toxicology Studies (Principii și practici de integrare a evaluării genotoxicității în studiile toxicologice de rutină): A Pharmaceutical Industry Perspective (O perspectivă a industriei farmaceutice). Environ. Molec. Mutagen. 32:115-120.
24. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. și Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays (Analiza statistică a testelor citogenetice in vivo) In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Subcomitetul UKEMS privind orientările pentru testarea mutagenității, Raport, partea III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney pp. 184-232.
25. Luke, C.A., Tice, R.R., Drew, R.T. (1988). The Effect of Exposure Regimen and Duration on Benzene-Induced Bone-Marrow Damage in Mice in Mice. I. Comparație între sexe la șoarecii DBA/2. Mutation Res. 203:251-271.
26. MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., Ramel C., Salamone, M.F., Tice, R.R. și Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res. 189:103-112.
27. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., și Wehr, C.M. (1983). Micronuclei în eritrocitele circulante: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. în: „Developments in Science and Practice of Toxicology”, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell și T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
28. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. și Gould, D.H. (1980). Clastogen-Induced Micronuclei in Clastogen-Induced in Peripheral Blood Erythrocytes: The Basis of an Improved Micronucleus Test. Environ. Mutagenesis 2:509-514.
29. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The In Vivo Erythrocyte Erythrocyte Micronucleus Test: Măsurarea în stare stabilă crește eficiența testului și permite integrarea cu studiile de toxicitate. Fund. Appl. Toxicol. 14:513-522.
30. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., și Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120:269-275.
31. Matter, B.E. și Schmid, W. (1971). Deteriorarea cromozomială indusă de trenimon în celulele măduvei osoase a șase specii de mamifere. Mutation Res. 12:417-425.
32. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. și Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res. 239:29-80.
33. Miller B.M. și Adler I.-D. (1990). Application of Antikinetochore Antikinetochore Antibody Staining (CREST Staining) to Micronuclei in Erythrocytes Induced In Vivo. Mutagenesis 5:411-415.
34. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. (1986). Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity Fluorescence Hybridization. Proc. Natl. acad. Sci. USA 83:2934-2938.
35. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. și Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. Subcomitetul UKEMS privind orientările pentru testele de mutagenitate. Raport. Partea I revizuită. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
36. Romagna, F. și Staniforth , C.D.(1989). The Automated Bone Marrow Micronucleus Test. Mutation Res. 213:91-104
37. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1982). A Rapid Screen for Cumulative Chromosomal Damage in Mice. Acumularea de eritrocite micronucleate circulante. Mutation Res. 113:481-487.
38. Schlegel, R., MacGregor, J.T. (1983). The Persistence of Micronuclei in Peripheral Blood Erythrocytes (Persistența micronuclei în eritrocitele din sângele periferic): Detection of Chronic Chromosome Breakage in Mice. Mutatation Res. 104:367-369.
39. Schlegel, R. și MacGregor, J.T. (1984). The Persistence of Micronucleated Erythrocytes in the Peripheral Circulation of Normal and Splenectomized Fischer 344 Rats (Persistența eritrocitelor micronucleate în circulația periferică a șobolanilor Fischer 344 normali și splenectomizați): Implicații pentru screeningul citogenetic. Mutation Res. 127:169-174.
40. Schlegel, R., MacGregor, J.T. și Everson, R.B. (1986). Evaluarea daunelor citogenetice prin cuantificarea micronuclei în eritrocitele din sângele periferic uman. Cancer Res. 46:3717-3721.
41. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test. Mutation Res. 31:9-15.
42. Schriever-Schwemmer G. și Adler I.-D. (1997). Differentiation of Micronuclei in Mouse Bone Marrow Cells: A Comparison between CREST Staining and Fluorescence In Situ Hybridization with Centromeric and Telomeric DNA Probes. Mutagenesis 9:333-340.
43. Schriever-Schwemmer G., Kliesch U., and Adler I.-D. (1994). Micronuclee extrudate induse de colchicină sau acrilamidă conțin în cea mai mare parte cromozomi întârziați identificați în frotiurile Paintbrush prin sonde ADN minore și majore de șoarece. Mutagenesis 12:201-207.
44. Tice, R.R., Furedi-Machacek, M., Satterfield, D.N.A., Udumudi, A., Vasquez, M., Dunnick, J.K. (1998). Măsurarea eritrocitelor micronucleate și a leziunilor ADN în timpul ingestiei cronice de fenolftaleină la șoareci femele transgenice heterozigote pentru gena p53. Environ. Molec. Mutagen. 31:113-124.
45. Tsuchimoto, T. și Matter, B.E. (1979). In Vivo Cytogenetic Screening Methods for Mutagens, with Special Reference to the Micronucleus Test. Arch. Toxicol. 42:239-248.
46. Vanderkerken K., Vanparys Ph., Verschaeve L., și Kirsch-Volders M. (1989). The Mouse Bone Marrow Micronucleus Assay Can be Used to Distinguish Aneugens from Clastogens. Mutagenesis 4:6-11.
47. Verschaeve L., Vanderkerken K., and Kirsch-Volders M. (1988). C-banding as a Simple Tool to Discriminate between Micronuclei Induced by Clastogens and Aneugens. Stain Technol. 63:351-354.
48. Witt, K.L., Gulati, D.K., Kaur, P., Shelby, M.D. (1995). Fenolftaleină: Inducerea eritrocitelor micronucleate la șoareci. Mutation Res. 341:151-60.
49. Yamamoto K.I. și Kikuchi Y. (1980). A Comparation of Diameters of Micronuclei Induced by Clastogens and by Spindle Poisons. Mutation Res. 71:127-131.
50. Yamamoto K.I. și Kikuchi Y. (1980). (1981). Studies on Micronuclei Time Response and on the Effects of Multiple Treatments of Mutagens on Induction of Micronuclei. Mutation Res. 90:163-173.

.