Un hidrogel de ADN producător de ARN ca platformă pentru un sistem de interferență cu ARN de înaltă performanță

Sinteza și caracterizarea I-gelului

Cele patru oligonucleotide de ADN X (X01-X04 șiruri de ADN) au fost sintetizate în comerț de Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, SUA). Secvențele de X-DNA (tabelul suplimentar 5) au fost proiectate, preparate și caracterizate urmând aceleași proceduri descrise în literatura de specialitate, cu ușoare modificări10,13. Șirurile de ADN liofilizate la scară de 1 μmol au fost colectate prin centrifugare la 14.000 g timp de 15 s la temperatura camerei. Fiecare șuviță de ADN a fost resuspendată la o concentrație de 1,0 mM în tampon TE 1x (pH 8,0). Fiecare tub a fost agitat și amestecat cu ajutorul MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, SUA) la 1500 rpm timp de ~3 h pentru a dizolva complet oligonucleotidele liofilizate. În total, 0,05 μmol (50 μl) din fiecare catenă de ADN a fost combinată într-un tub de 1,5 ml și s-a adăugat apă fără nucleaze, volumul total al amestecului de oligonucleotide ajungând la 500 μl. 100 μl de amestec de oligonucleotide au fost distribuiți în tuburi de 0,5 ml. Tuburile au fost plasate într-un termociclator (Bio-Rad, CA, SUA). Cele patru tipuri de oligonucleotide (X01 ~04) au fost recoapte în următoarele condiții: denaturare inițială la 95 °C timp de 10 min; și 65 °C timp de 2 min, 60 °C timp de 5,5 min, scădere cu 1 °C menținând 1 min la această temperatură, 20 °C timp de 30 s și scădere la 4 °C pentru stabilizarea și stocarea ADN X. Apoi, pentru schimbul de tampon, soluția de ADN-X recoaptă (500 μl) într-o unitate de filtrare (cutoff Mw de 3 kDa) pentru microcentrifugare a fost centrifugată timp de 6 h la 15 000 g și 4 °C pentru a reduce volumul de solvent. Unitatea de filtrare a fost transferată într-un tub de centrifugare nou. În total, în unitatea de filtrare s-au adăugat 100 μl de apă fără nucleaze la 4 °C. Unitatea de filtrare a fost centrifugată timp de 4 ore la 15 000 g și 4 °C pentru a spăla ADN-X de sărurile rămase. Modulul de filtrare de tăiere trebuie așezat cu capul în jos în tub și centrifugat la 2000 g timp de 3 min la 4 °C. Adăugarea de apă fără nucleaze și centrifugarea au fost efectuate de încă două ori folosind același tub de centrifugare pentru a elimina complet sarea reziduală din X-DNA. Volumul final al soluției de X-DNA va fi de ~300 μl. Plasmidul de expresie a siARN (I-plasmid) a fost achiziționat și preparat la scară maximă de Cosmo Genetech (Seul, Coreea de Sud). Pentru a construi I-plasmidele I, I-plasmidele au fost liniarizate cu ajutorul enzimei de restricție BamHI. Dimensiunea genei siARN a fost de 66 pb cu distanțierul (sau 498 pb cu promotorul T7) (a se vedea figura suplimentară 4 pentru harta I-plasmidică). Cantitățile de ADN din probe au fost determinate din valoarea de absorbție UV/Vis a acestora cu ajutorul unui BioSpectrometru (Eppendorf, Hamburg, Germania). ADN-X și plasmidele liniare au fost mai întâi amestecate într-un raport molar prestabilit în prezența ADN ligazei T4 (Promega, Madison, WI, SUA) pentru a sintetiza Dgelul. Pentru un raport X-DNA:I-plasmidă de 1500:1, am utilizat 10,5 μL de 75 μM X-DNA și 5,25 μL de 100 nM plasmidă într-un volum de reacție de 30 μL. Pentru experimentul Blank-gel, aceeași cantitate de material X-DNA ca și în I-gel a fost ligaturată cu ADN ligază T4. 10 µL din fiecare probă au fost amestecate cu 2 µL de tampon de încărcare a gelului și electroforezate pe un gel de agaroză de 0,7 sau 2% la 100 V timp de 60 min. Toate ADN-urile (X-DNA, I-plasmid, Blank-gel și I-gel) au fost confirmate prin electroforeză pe gel de agaroză (figurile suplimentare 3, 11, 18). D-gelurile sintetizate au fost desalinizate de două ori cu ajutorul filtrelor centrifugale microtubulare Amicon de 3 kDa Mw cutoff. Pentru imagistica prin microscopie electronică de scanare (SEM), probele au fost liofilizate într-un liofilizator FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, SUA) până când toată apa a fost eliminată. Probele uscate au fost crăpate pentru a descoperi suprafețele lor proaspete. După ce au fost acoperite prin pulverizare cu un strat de Pt de 2~ 3 nm timp de 100 s, morfologiile acestor suprafețe de hidrogel au fost observate la o mărire de ~50.000× cu ajutorul unui microscop electronic de scanare S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japonia) la o tensiune de accelerare de 15 kV (Figura suplimentară 19).

Test de stabilitate I-gel

Sapte probe au fost pregătite pentru fiecare dintre I-plasmidă liberă și I-gel. În fiecare probă, 2 µL de I-plasmidă liberă (57 ng) sau I-gel (1:1500 gel conținând 57 ng de I-plasmidă) au fost diluate în 12 µL de apă distilată, apoi s-au adăugat 4 µL de tampon 5 × optimizat pentru transcriere și tratate cu 3,33 × 10-5 unități de DNază I (nr. M6101; Promega) la 20 µL de volum final, urmate de incubare la 37 °C timp de 0, 1, 4, 12, 24 și, respectiv, 48 h. După incubare, probele de 20 µL au fost separate în două alicote de 10 µL, una pentru electroforeză și alta pentru transcrierea ulterioară. În fiecare alicotă, reacția de denaturare a fost încheiată prin adăugarea a 1 µL de soluție de oprire a DNazei RQ1 și incubarea timp de 10 min la 65 °C. Ulterior, 10 µL din fiecare probă au fost amestecate cu 2 µL de tampon de încărcare a gelului și electroforezate pe un gel de agaroză 2% la 100 V timp de 60 min (figura suplimentară 13). O altă parte alicotă din fiecare probă a fost utilizată pentru reacția de transcriere pentru a demonstra eficiența de transcriere a I-gelului după reacția de digestie. ARNhc au fost transcrise din șabloanele I-gel sau I-plasmidice libere (0, 24, 48 h) utilizând kitul de transcriere (Riboprobe; Promega), conform instrucțiunilor producătorului. ARNmii shRNA obținuți au fost cuantificați prin RT-qPCR, așa cum este descris în secțiunile Pregătirea ARN total și transcrierea inversă și PCR în timp real și analiza datelor (tabelul suplimentar 4).

Analize de expresie și inhibiție a proteinelor

Cuplul kituri de transcriere și traducere cuplată (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, nr. de catalog 88882) au fost achiziționate de la Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, SUA), iar reacțiile au fost efectuate urmând procedurile sugerate de producător. Pe scurt, lizatul de celule HeLa, proteinele accesorii, amestecul de reacție și plasmidul pcDNA3.1( + ) IRES GFP (0,5 μg/μL; nr. 51406; Addgene, Cambridge, MA, SUA) au fost amestecate în proporție de 12,5:2.5:5:5:2 (v/v) și au fost incubate la 30 °C timp de 1, 2, 4 și 6 h. După timpii de reacție indicați, soluțiile de probă au fost incubate timp de 24 h la 4 °C atât pentru a opri reacția, cât și pentru a asigura un timp suficient de pliere a proteinelor. Pentru a evalua eficiența interferenței, s-a adăugat I-plasmidă liberă sau I-gel la lizatul celular în prezența a 1000 ng de plasmidă GFP. În experimentele de control pentru condiția I-gel optimizată care conținea 57 ng de I-plasmidă (17,5 nmol), ARNhc încâlcit (17,5 nmol și 1,75 μmol; 1 eq și, respectiv, 100 eq la cantitatea de I-plasmidă) (SN-1003; Bioneer, Seul, Coreea), amestec de plasmidă încâlcită (17.5 nmol; amestec de plasmidă de expresie shRNA încâlcit; Cosmo Genetech), gel de plasmidă încâlcită (amestec de plasmidă încâlcită încrucișată enzimatic cu ADN-X), componenta I-gel (numai ADN-X, numai plasmidă-I sau acest amestec fără încrucișare enzimatică; adică fără formare de gel) sau Blank-gel (încrucișare enzimatică numai a ADN-X) au fost adăugate direct în soluția de reacție de expresie GFP. Toate reacțiile au fost efectuate de cel puțin trei ori. Cu excepția cazului în care se specifică altfel, volumul de reacție a fost menținut la 25 μL. Spectrele de fluorescență au fost analizate cu ajutorul unui spectrofluorofotometru (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd..; SCINCO Co., Ltd.), Seul, Coreea) pentru a determina nivelul de expresie GFP în soluția de lizat celular.

Prepararea ARN total și transcrierea inversă

Ca un control de tip „spike-in”, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL; nr. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canada) a fost adăugat la toate lizatele celulare preexprimate (20 µL) înainte de extragerea ARN. Apoi, ARN total a fost extras din 23 µL de lizat cu ajutorul reactivului TRIzol (Ambion, Thermo Fisher Scientific) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. ARN-ul total extras a fost dizolvat în 10 µL de apă tratată cu DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Apoi, 2 µL de ARN total au fost poliadenilate cu 1 mM ATP în 1 × tampon de poli(A) polimerază conținând 5 U de poli(A) polimerază Escherichia coli (New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA) la 37 °C timp de 30 de minute într-un amestec de reacție de 20 µL. Pentru transcrierea inversă, 4 µL de ARN de coadă au fost amestecate cu 1 pmol de primer RT și un amestec de 0,5 mM dNTP și apoi completate până la un volum de 13 µL cu apă tratată cu DEPC. Amestecul a fost încălzit la 65 °C timp de 5 minute și apoi a fost răcit rapid la gheață. Amestecul de reacție a fost apoi completat până la un volum final de 20 µL prin adăugarea de 5 mM ditiotreitol, 1 × soluție tampon first-strand, 40 U de inhibitor de RNază și 200 U de SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) și a fost incubat la 50 °C timp de 1 oră, urmat de inactivarea enzimei la 70 °C timp de 15 minute. Secvențele de primer RT (a se vedea tabelul suplimentar 5) au fost proiectate pentru sinteza ADNc din secvența de ARN. Primerul utilizat a fost adaptorul 3′ RACE, care este furnizat în kitul FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Toți primerii au fost sintetizați de Cosmo Genetech, cu excepția primerului înainte cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). Rata de recuperare a ARN-ului în fiecare soluție de lizat a fost estimată din diferența dintre valoarea CT a controlului spike-in obținut și cea a referinței cel-miR-39 (care nu a procedat la procesul de extracție).

Real-time PCR și analiza datelor

Cantitățile de ARNm shRNA și GFP au fost cuantificate prin qPCR cu ajutorul sistemului StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). qPCR-ul fiecărei probe a fost efectuat într-un volum total de 20 µL cu 2 µL de ADNc, 10 µL de 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) și 10 pmol din fiecare primer. Amplificarea a fost efectuată în următoarele condiții: denaturare inițială la 95 °C timp de 10 minute; și 30 de cicluri de 95 °C timp de 15 s, 60 °C timp de 30 s și 72 °C timp de 30 s. qPCR a fost efectuată, de asemenea, cu cel-miR-39 ca ARN de referință pentru a obține rata de recuperare a ARN total în fiecare probă. Protocolul qPCR a fost același cu cel descris mai sus în această secțiune, cu excepția primerilor utilizați, care au fost 10 pmol de un primer invers comun (același ca și primerul invers al ARNhc) și primerul înainte cel-miR-39. Curba de topire a fiecărui produs de ADN amplificat a fost obținută prin măsurarea modificării intensității fluorescenței colorantului SYBR Green de șase ori pentru fiecare probă, în timp ce temperatura creștea de la 60 °C la 95 °C la o rată de + 0,3 °C/s după finalizarea qPCR. Amorsele specifice pentru qPCR au fost proiectate cu ajutorul programului Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (tabelul suplimentar 5). Expresia relativă a țintelor a fost determinată prin utilizarea metodei comparative 2-ΔΔCT. Cantitatea relativă de ARNm GFP a fost, de asemenea, confirmată prin măsurarea intensității benzilor pe gel de agaroză 2%. Amplificarea ADNc a fost realizată cu aceleași condiții și program PCR ca și cele utilizate pentru qPCR descrise mai sus, cu excepția numărului de cicluri PCR (20 pentru ARNm GFP).

Calibrarea și cuantificarea cantității absolute de ARN

Curbele standard pentru concentrația de ARN și valoarea CT au fost obținute prin utilizarea fiecărui material standard de ARN. Pentru ARNhc, curba standard a fost obținută prin utilizarea ARNc sintetizat achiziționat de la Integrated DNA Technologies. Pentru ARNm GFP, curba a fost obținută folosind ARNm GFP extras dintr-un kit de transcriere (Riboprobe; Promega) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Cantitatea de ARN al ARNm standard a fost informată de Integrated DNA Technologies, în timp ce cea a ARNm GFP standard extras a fost determinată pe baza valorii sale de absorbție UV/Vis cu ajutorul BioSpectrometrului. ARN-urile standard obținute au fost convertite în ADNc prin transcriere inversă, așa cum s-a descris mai sus în secțiunea „Prepararea ARN-ului total și transcrierea inversă”. După aceea, ADNc a fost diluat de 10, 100, 1000 și 10 000 de ori, iar apoi qPCR a fost repetat de trei ori, iar valorile CT obținute au fost utilizate pentru a obține o curbă standard. Valorile CT obținute în urma RT-qPCR au fost convertite în concentrațiile inițiale de ARN din lizații celulare printr-un proces de calibrare (Figura suplimentară 6). Cantitatea absolută finală de ARN a fost determinată prin înmulțirea fiecărei rate de recuperare a ARN (%) și a valorii cantității de ARN din curba de calibrare (tabelele suplimentare 1, 2).

Etichetare celulară cu Cy5-I-gel

Celulele Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) au fost obținute de la Korea Cell Line Bank (Seul, Coreea) și menținute în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin și 1% penicilină-streptomicină într-un incubator umezit și menținut cu CO2 (5%). Celulele MDCK care exprimă GFP (MDCK-GFP) au fost pregătite prin transfectarea vectorului pEGFP-N1 în celule cu ajutorul reactivilor Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific), în conformitate cu protocolul producătorului. Ulterior, am sortat celulele care emit GFP cu ajutorul sistemului FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SUA). Pe tot parcursul cercetării, celulele au fost testate negativ pentru contaminarea cu micoplasme. Celulele MDCK-GFP cultivate în plăci de 24 de godeuri cu capac (50.000 de celule pe fiecare gode) au fost coincubate cu gelul Cy5-I-gel (Cy5-I-gel conjugat cu Cy5) care conține șiruri de secvențe de ADN X01 conjugate cu Cy5 (corespunzând la 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) în mediu fără ser timp de 4 h. Pentru a pregăti plasmidul Cy5-I-plasmid, Cy5-dsDNA (Cy5-dsDNA conjugat Cy5) a fost mai întâi preparat prin aneantizarea X01 conjugat Cy5 (cu o extremitate lipicioasă suplimentară 5′-p-GATC) și a contrașirului său complementar (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Apoi, ADN-ds Cy5 și plasmidul I au fost amestecate și ligaturate la un raport molar de 5000:1. Excesul de Cy5-dsDNA nelegat a fost eliminat prin centrifugare (12 400 g, 4 °C, 60 min) folosind filtre centrifugale microtubulare Amicon (50 kDa Mw cutoff) de 4-5 ori. Cy5-shRNA (ShRNA conjugat cu Cy5) a fost sintetizat în comerț (Integrated DNA Technologies). Pentru seturile Cy5-I-plasmidă și Cy5-shRNA, celulele au fost coincubate cu 2,625 nM din fiecare probă în mediu fără ser timp de 4 h. Pentru seturile Lipofectamina-Cy5-I-plasmidă și Lipofectamina-Cy5-shRNA, Lipofectamina și proba conjugată cu Cy5 au fost complexate electrostatic prin amestecarea lor într-un raport molar de 1:1 până la o concentrație finală a soluției de 2,625 μM Lipofectamina și 2,625 μM substrat. Apoi, celulele au fost coincubate cu 2,625 μM de Lipofectamină-Cy5-I-plasmidă sau Lipofectamină-Cy5-shRNA în mediu fără ser timp de 4 h, respectiv cu Lipofectamină-Cy5-shRNA. În cazul controlului exclusiv celular, celulele au fost coincubate cu DMEM fără ser, conținând 1% (v/v) penicilină (HyClone). După 4 h de coincubare, toate probele au fost spălate de două ori cu soluție tampon de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (0,1 M, pH 7,4), iar celulele au fost incubate în continuare timp de 6 h într-un mediu de creștere care conține 10% (v/v) de ser fetal bovin (FBS; HyClone) și 1% penicilină pentru a asigura un timp suficient de recuperare celulară și de absorbție. Celulele cultivate au fost fixate cu formaldehidă 4% timp de 10 minute la temperatura camerei și au fost spălate în continuare de trei ori cu tampon PBS (0,1 M, pH 7,4). Pentru imagistica la microscop, lamboanele de acoperire cu celulele atașate au fost montate pe lame de sticlă folosind un mediu de montaj apos cu un agent anti-dezlipire. Imaginile de fluorescență au fost înregistrate cu ajutorul unui microscop Zeiss Axioplan 2, iar fotografiile au fost realizate cu ajutorul unei camere Zeiss Axiocam HR.

Experiment de suprimare a genei GFP folosind I-gelul

În primul rând, I-gelul care conținea 262,5 µM X-DNA și 175 nM I-plasmidă a fost incubat cu 300 U de ARN polimerază T7 (Thermo Fisher Scientific) timp de 15 minute la temperatura camerei. După incubare, proba I-gel a fost diluată de 100 de ori în DMEM fără ser, conținând 1% penicilină. Apoi, 1/6 din volumul complexului I-gel/polimerază a fost adăugat în fiecare fântână a unei plăci de 24 de godeuri cu capac care a fost preplătită cu celule MDCK-GFP (20 000 de celule pe fântână) timp de 24 h. Pentru seturile de gel I-plasmid, amestec de plasmidă încurcată și gel de plasmidă încurcată, celulele MDCK-GFP au fost cultivate împreună cu aceeași cantitate molară din fiecare plasmidă și ARN polimerază T7 ca în cazul I-gelului. Pentru măsurarea efectului ARNi al ARNhc gol și al ARNhc Lipofectamină, s-a utilizat o cantitate de 100 de ori mai mare din fiecare probă de ARN în raport cu numărul de șabloane de plasmidă I, luând în considerare rata de expresie a ARNhc din gelul I, calculată în urma experimentului cu lizat celular. Pentru seturile de ARNhc gol și ARNhc brăzdat, celulele MDCK-GFP au fost coincubate cu 175 nM de eșantion de ARN. Probele complexate cu lipofectamină au fost preparate în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pentru seturile de amestecuri Lipofectamină-I-plasmidă și Lipofectamină-plasmidă încâlcită, Lipofectamina și fiecare probă de plasmidă au fost complexate electrostatic prin amestecarea lor într-un raport molar de 5:1 pentru a obține o concentrație finală a soluției de 8,75 nM Lipofectamină și 1,75 nM substrat plasmidic. Pentru setul Lipofectamine-shRNA, Lipofectamina și shRNA liber au fost complexate electrostatic prin amestecarea lor într-un raport molar de 5:1 pentru a obține o concentrație finală a soluției de 875 nM Lipofectamină și 175 nM shRNA. Celulele MDCK-GFP au fost coincubate cu probele complexate cu Lipofectamină, așa cum au fost preparate, în mediu fără ser, timp de 4 h. Pentru setul exclusiv celular, doar celulele MDCK-GFP au fost incubate în mediu fără ser timp de 4 h, fără probe. Toate probele au fost spălate după perioada de coincubare de 4 h, iar celulele au fost incubate suplimentar timp de 48 h cu mediul de creștere (DMEM conținând 10% (v/s) FBS și 1% penicilină) pentru a evalua efectul de silentificare a ARN-ului la 37 °C sub 5% CO2. Celulele au fost apoi fixate cu formaldehidă 4% timp de 10 minute la temperatura camerei și spălate cu tampon PBS (0,1 M, pH 7,4). Pentru imagistica la microscop, celulele atașate pe lamele de sticlă au fost montate pe lamele de sticlă folosind un mediu de montaj apos cu un agent anti-dezlipire.

Analiză a expresiei genelor prin PCR cantitativă în celule vii

Toate probele au fost tratate la și incubate în fiecare mediu celular în aceeași cantitate și în aceleași condiții ca și cele folosite în experimentul de silențiere a genei GFP descris anterior folosind secțiunea I-gel. După incubare, mediul celular a fost aspirat din plăcile de cultură celulară, iar celulele MDCK-GFP au fost spălate o dată cu tampon PBS și au fost tripsinizate pentru a detașa celulele din fiecare puț al plăcii. Celulele detașate au fost diluate cu soluție tampon PBS pentru a dezactiva tripsina, iar apoi au fost colectate într-un microtub de 1,5 ml și au fost aglomerate prin centrifugare (180 g, 5 minute). Supernatantul a fost îndepărtat, iar celulele au fost diluate cu 20 µL de tampon PBS. Soluția de suspensie celulară (20 µL) a fost tratată cu 1 ml de reactiv TRIzol, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL) și 200 µL de soluție de cloroform. Extracția ulterioară a ARN-ului a fost efectuată în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pentru cuantificarea cantității relative de ARNm GFP și ARNm shRNA la nivel celular, toate qPCR-urile preparatelor de probe au fost efectuate prin aceeași metodă descrisă în secțiunile „Pregătirea ARN total și transcrierea inversă” și „PCR în timp real și analiza datelor”.

Analiza imaginii celulare pentru cuantificarea intensității pixelilor

Prin procesarea imaginii celulare, datele au fost efectuate cu ajutorul programului MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, SUA). Imaginile de fluorescență brute au fost importate în MATLAB, iar fiecare pixel din imagini a fost convertit în fiecare componentă a matricei. Distribuția intensităților de fluorescență ale fiecărei componente a fost reprezentată grafic printr-o histogramă. Întregul set de date a fost împărțit în 256 de intervale.

Analiză de sortare celulară activată prin fluorescență

Celele au fost spălate o dată cu 1 ml de PBS, urmată de aspirarea mediului de creștere din plăcile de cultură celulară. Apoi, celulele au fost detașate de pe placă prin tratare cu tripsină. Celulele detașate au fost colectate într-un tub de 15 ml, urmate de o centrifugare din care a rezultat un pellet (180 g, 3 min). Soluția supranaturală de tripsină a fost îndepărtată, iar peleta celulară a fost spălată de două ori cu 2 ml de PBS. Celulele au fost resuspendate în PBS la o concentrație de 50.000 de celule/mL. Apoi, probele au fost pregătite prin fixarea celulelor în soluție de formaldehidă 1% timp de 10 minute la temperatura camerei. Probele au fost analizate pentru intensitatea fluorescenței GFP cu ajutorul sistemului FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SUA).

Niveluri de viabilitate relativă în condiții de întuneric

O suspensie de celule MDCK-GFP (5 000 de celule pe puț) a fost distribuită într-o placă cu 96 de puțuri (Corning Inc., Corning, NY, SUA) și incubată timp de 1 zi la 37 °C sub 5% CO2. După ce celulele s-au fixat pe placă, acestea au fost coincubate cu diferite concentrații de I-gel (corespunzătoare concentrației de ADN-X) în mediul de creștere (DMEM conținând 10% (v/v) FBS și 1% penicilină) la întuneric. I-gelul a fost compus dintr-un raport molar X-ADN:I-plasmidă de 1500:1. Aceste probe au fost incubate timp de 6, 24 și 48 de ore la 37 °C la 5% CO2. La sfârșitul fiecărui timp de incubare, soluția Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japonia) a fost adăugată la probe în conformitate cu instrucțiunile producătorului. După o incubare suplimentară timp de 1 h, absorbția la 450 nm a fost măsurată cu ajutorul unui cititor de microplăci. Rezultatele acestei măsurători au fost exprimate ca raport între absorbanța probei și cea a celulelor de control negativ fără incubarea probei.

Analiză statistică

Analiza statistică a fost efectuată cu software-ul Prism 7.05 (GraphPad Software) pentru testul t al lui Student, ANOVA cu o singură cale cu post-test de comparații multiple Bonferroni. Testul de postcomparare multiplă Holm-Bonferroni a fost efectuat utilizând rezultatele posttestului de postcomparare multiplă Bonferroni din software-ul Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Testul de normalitate a fost calculat prin testul Shapiro-Wilk. În rezultatele testului Shapiro-Wilk, Datele au fost distribuite aproximativ normal. Semnificația statistică este indicată ca *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

.