Utilizarea polimerului de polietilenimină în cultura celulară ca factor de atașare și potențiator de lipofecție

PEI promovează atașarea celulelor slab ancorate și a țesuturilor primare

Celele PC-12 sunt utilizate ca model de diferențiere neuronală în laborator, deoarece tratamentul acestor celule cu factorul de creștere nervoasă (NGF) induce extinderea neuronilor și exprimarea markerilor biochimici ai fenotipului neuronal simpatic . Acestea se dezvoltă ca celule slab ancorate, iar polimerii de colagen sau de polilizină sunt frecvent utilizați pentru preacoperirea plăcilor pentru cultura celulelor PC-12 . Celulele PC-12 au fost cultivate în laborator în godeuri naive sau în godeuri preacoperite cu diverși factori de fixare (plăci de cultură tisulară multiwell-12), pentru a observa efectul asupra ancorării celulelor la substrat. În absența oricărui agent de acoperire, celulele au prezentat o tendință caracteristică de a forma grupuri de celule care se acumulează spre centrul puțului; aceste celule sunt ferm atașate între ele, dar foarte slab atașate de vasul de cultură de țesut (figura 1D). Acest lucru are ca rezultat o distribuție foarte eterogenă a celulelor (foarte puține celule rămân spre marginea godeurilor) și o pierdere semnificativă de celule în timpul procedurilor de spălare sau de schimbare a mediului. Pretratarea plăcilor cu PEI a dus la o distribuție semnificativ mai omogenă a celulelor în godeuri, cu celule care se atașează ferm de placă, prezentând o tendință mult mai mică de grupare (figura 1A). Pentru comparație, plăcile au fost, de asemenea, pretratate cu alți agenți de acoperire utilizați în mod obișnuit, colagen (figura 1B) și poli-D-Lizină (PDL; figura 1C), rezultând, de asemenea, o fixare mai fermă a celulelor pe plăci și o distribuție mai omogenă a celulelor.

Pentru a testa în continuare proprietatea de îmbunătățire a ancorării observată cu pretratarea PEI a vaselor de cultură, a fost utilizat un al doilea sistem. Explantele de retină de la peștii teleostești au fost utilizate în studiul regenerării nervoase . Atunci când se aplică o leziune nervului optic al peștilor, se inițiază un răspuns de regenerare, iar celulele ganglionare retiniene (RGC) ale retinei își prelungesc din nou axonul spre țesutul țintă tectal. Dacă retina de la un astfel de pește „amorsat” este explantată și cultivată, răspunsul de regenerare este observat in vitro prin extinderea accelerată a neviților lungi. Cu toate acestea, acest fenomen necesită utilizarea matricei extracelulare sau a factorilor de atașament (de exemplu, colagen sau acoperire PDL), deoarece explantele prezintă o afinitate foarte scăzută pentru suprafața de plastic neacoperită. S-au efectuat experimente pentru a observa dacă PEI ar putea acționa ca un factor de atașament care să favorizeze extinderea axonală din explantele de retină de pește zebră. Explantele de retină din ochii de pește zebră de control au fost capabile să se atașeze la vasele de cultură tratate cu PEI (figura 1E). Mai mult, explantele de retină de la peștii care au primit o leziune condiționată au fost capabile să extindă axonii în mod viguros atunci când au fost cultivate folosind PEI ca factor de atașare (Figura 1F).

Rezultatele obținute cu explantele de retină au sugerat că celulele neuronale atașate la vasele acoperite cu PEI se pot diferenția, generând neurite care se atașează bine de substrat. Pentru a testa această ipoteză cu celulele PC-12 pro-neuronale, s-au efectuat experimente de diferențiere prin tratament cu NGF cu celule atașate la farfurii acoperite cu PEI. Celulele PC-12 tratate cu NGF au rămas ferm atașate de farfurie timp de mai multe zile, generând rețele de neviți (figura 2). Rezultatele indică faptul că PEI este permisiv pentru procesul de diferențiere și pentru atașarea neviților la farfurie. Celulele diferențiate au rămas ferm ancorate pe tot parcursul experimentelor de imunocitochimie (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García și R. P. Ballestero, rezultate nepublicate).

Forța de ancorare a celulelor eucariote la vasele de cultură pretratate cu PEI și alți factori de fixare

Au fost selectate trei linii celulare diferite pentru a testa capacitatea PEI de a promova o ancorare puternică la vasele de cultură din plastic. Celulele PC-12 și HEK-293 au fost descrise mai sus ca fiind slab ancorate. Pe de altă parte, celulele MYS sunt fibroblaste primare care aderă puternic la vasele de cultură din plastic, crescând pentru a forma un monostrat de celule pe suprafață. Pentru a testa puterea de ancorare a diverselor celule la plăci, s-a realizat un protocol în care s-au efectuat 4 spălări consecutive cu tampon izotonic, urmate de utilizarea unui protocol colorimetric pentru numărarea celulelor care au rămas în placă (pe baza colorantului vital roșu neutru). Plăcile pretratate cu diverși factori de atașare au fost comparate cu plăcile care nu au primit niciun tratament prealabil (netratate). Experimentele au fost efectuate în triplu exemplar și s-au calculat mediile de colorant reținut în plăcile care au primit fiecare tratament. Aceste medii au fost normalizate la media obținută cu pretratarea cu PEI, căreia i s-a atribuit valoarea arbitrară de 100,0% în toate experimentele. Rezultatele experimentelor reprezentative cu cele 3 linii celulare sunt prezentate în figura 3 (cel puțin trei experimente independente au fost efectuate cu fiecare linie celulară). Celulele PC-12 s-au atașat aproape la fel de bine la plăcile acoperite cu PEI, colagen sau PDL (număr relativ de celule de 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % și 96,3 % ± 5,8 %, pentru PEI, colagen și, respectiv, PDL). Cu toate acestea, s-a observat o pierdere semnificativă de celule atunci când s-au comparat plăcile netratate cu plăcile pretratate cu PEI, cu un număr relativ de celule de 43,9 % ± 5,8 % (figura 3A). În cazul HEK-293, celulele s-au atașat puternic atât la godeurile pretratate cu PEI, cât și la cele pretratate cu PDL. În experimentul reprezentativ prezentat în figura 3B, numărul relativ cu aceste două tratamente a fost de 100,0% ± 0,4% și, respectiv, 96,8% ± 1,7%. Cu toate acestea, un număr mare de celule au fost pierdute atunci când au fost plasate în godeurile netratate (număr relativ de 8,3 % ± 0,6 %) sau în godeurile care au fost pretratate cu colagen (11,5 % ± 1,2 %), ceea ce sugerează că aceste celule se atașează destul de slab la godeurile din plastic sau la cele acoperite cu colagen. În cele din urmă, atunci când au fost utilizate celule fibroblaste (celule MYS), celulele păreau să se atașeze destul de bine la toate cele patru suprafețe, inclusiv la godeurile netratate (figura 3C). Figura 3C prezintă un grafic reprezentativ, afișând un număr relativ de celule MYS de 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % și 77,1 % ± 1,4 %, cu godeuri pretratate cu PEI, colagen sau PDL sau, respectiv, godeuri netratate. Prin urmare, această linie celulară se atașează destul de bine la suprafața de plastic netratată, comparativ cu liniile celulare PC-12 și HEK-293.

Pentru a oferi o indicație a variației dintre experimente, s-au calculat mediile ± abaterile standard ale numărului relativ de celule obținute în experimentele independente pentru fiecare linie celulară și tratament (rețineți că, deoarece în toate experimentele, numărul de celule pentru godeurile pretratate cu PEI a fost stabilit la 100,0 %, valoarea pentru media globală cu acest agent de acoperire este exact 100,0 % pentru toate liniile celulare). Rezultatele comparative pentru celelalte tratamente sunt indicate mai jos. Pentru celulele PC-12, numărătoarea relativă a fost de 81,5 % ± 8,8 % pentru godeurile tratate cu colagen (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % pentru godeurile tratate cu PDL (n = 4) și 52,1 % ± 13,7 % pentru godeurile netratate (n = 4). Pentru celulele HEK-293, numărul relativ a fost de 16,3 % ± 12,7 % pentru godeurile tratate cu colagen (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % pentru godeurile tratate cu PDL (n = 3) și 9,0 % ± 4,1 % pentru godeurile netratate (n = 3). În experimentele cu celule MYS, media numărului relativ cu godeuri tratate cu colagen a fost de 92,7% ± 16,2% (n = 3), 71,1% ± 6,7% pentru godeurile tratate cu PDL (n = 3) și 78,4% ± 11,5% pentru godeurile netratate (n = 3). Analiza statistică indică faptul că îmbunătățirea aderenței atât a celulelor PC-12, cât și a celulelor HEK-293 la vasele tratate cu PEI față de plasticul netratat este semnificativă (p < 0,05 și, respectiv, p < 0,01, analiza testului t), în timp ce nu este semnificativă din punct de vedere statistic pentru celulele MYS (p > 0,05).

Pentru a caracteriza în continuare proprietățile PEI ca factor de fixare pentru celulele slab ancorate, au fost efectuate experimente pentru a analiza doza de PEI care poate asigura o ancorare optimă a celulelor, intervalul de numere de celule care pot beneficia de prezența PEI și stabilitatea PEI ca factor de fixare. Figura 4A prezintă rezultatele unui experiment reprezentativ de testare a rezistenței de fixare a celulelor HEK-293 pe vasele acoperite cu diferite doze de PEI. Numărul de celule a fost normalizat la valoarea obținută pentru tratamentul cu 25 μg/ml de PEI, care a fost stabilită la 100,0 %. Rezultatele indică faptul că concentrațiile de PEI de 2,5 μg/ml sau mai mari au dus la o intensificare maximă a atașamentului, ceea ce sugerează că suprafața vasului de plastic este complet acoperită de polimer la aceste concentrații. Concentrațiile mai mari de polimer nu au părut să aibă efecte toxice asupra celulelor dacă excesul de PEI rămas în soluție a fost eliminat complet (s-au observat ușoare efecte toxice la concentrația de 250 μg/ml dacă soluția nu a fost eliminată complet după tratament). Experimentul prezentat este reprezentativ pentru 4 experimente independente. Figura 4B reprezintă rezultatele obținute cu diferite numere de celule PC-12 și HEK-293. Figura prezintă numărul relativ de celule, unde o valoare arbitrară de 100,0 % a fost atribuită numărului mediu obținut din godeurile tratate cu PEI cu cel mai mare număr din fiecare linie celulară (3,2 × 105 celule HEK-293 și 1,5 × 106 celule PC-12). Rezultatele indică faptul că PEI a funcționat bine ca factor de atașare pe o gamă largă de numere de celule, atât pentru celulele PC-12, cât și pentru celulele HEK-293. Un număr mai mic de celule nu a putut fi testat în mod fiabil, deoarece acestea erau aproape de limita de sensibilitate a testului cu roșu neutru. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cel puțin 4 experimente independente efectuate cu fiecare linie celulară. Figura 4C prezintă rezultatele unui experiment efectuat pentru a testa stabilitatea PEI ca factor de atașare. În acest experiment, un set de plăci a fost tratat cu PEI și apoi păstrat în PBS la 4°C timp de 10 zile. Într-un al doilea test, plăcile au fost tratate cu PEI și păstrate (cu mediu) în incubatorul CO2 la 37°C timp de 3 zile, cu o schimbare a mediului efectuată la fiecare 24 h. Performanța PEI în aceste plăci a fost apoi comparată cu plăcile tratate cu PEI folosind protocolul standard descris pentru experimentele anterioare. Rezultatele arată numărul relativ de celule normalizate la media absorbțiilor obținute cu plăcile tratate cu PEI standard, care a primit valoarea arbitrară de 100,0%. Rezultatele indică faptul că acoperirea cu PEI rămâne stabilă pe suprafața vasului de plastic timp de cel puțin 10 zile de refrigerare și că aceasta nu este îndepărtată prin incubare la 37°C în mediu sau chiar prin schimbări repetate de mediu. Rezultatele sunt reprezentative pentru 4 experimente independente efectuate în triplu exemplar.

Pretratarea cu PEI îmbunătățește lipofectarea celulelor slab ancorate

Transfecția celulelor eucariote prin lipofecție implică mai multe etape, adăugări și înlocuiri de medii, care pot avea un efect negativ în cazul celulelor slab ancorate. Chiar dacă se are grijă să se evite pierderea celulelor, celulele slab ancorate pot fi mai puțin eficiente în absorbția complexelor de transfecție. Deoarece pretratarea cu PEI a vaselor de cultură celulară a crescut puterea de fixare a celulelor pe astfel de suprafețe, s-a emis ipoteza că factorul de fixare poate avea un efect pozitiv asupra randamentelor de transfecție obținute prin lipofecție. Cele trei linii celulare descrise mai sus au fost utilizate pentru a testa această ipoteză utilizând agenții de acoperire examinați anterior. Transfecțiile au fost efectuate cu o plasmidă care codifică enzima reporter β-galactosidază. Randamentul transfecției a fost monitorizat prin determinarea activității enzimei reporter în lizații de la celulele transfectate. S-au efectuat cel puțin două teste independente în triplu exemplar pentru fiecare linie celulară. Diagramele reprezentative sunt prezentate în figura 5. Randamentele (activitățile β-galactosidazei) au fost normalizate în raport cu activitatea obținută cu preacoperirea cu PEI, care a fost stabilită ca referință la 100,0 %. În general, s-a observat că randamentele de transfecție au fost îmbunătățite în cazul celulelor slab ancorate prin preacoperirea cu agenți care favorizează fixarea celulelor pe placă. În cazul celulelor PC-12, preacoperirea godeurilor cu PEI, colagen sau PDL a dus la o creștere de 2 până la 3 ori a randamentului de transfecție în raport cu godeurile netratate: randamente relative de 100,0% ± 1,4% pentru PEI, 87,0% ± 8,7% pentru colagen și 100,1% ± 2,4% pentru PDL, față de 42,9% ± 2,2% pentru godeurile netratate (figura 5A). Îmbunătățirea randamentului de transfecție prin pretratarea cu PEI a fost mai pronunțată pentru celulele HEK-293. Experimentul din figura 5B arată o activitate relativă de 21,1% ± 3,4% pentru celulele din godeurile netratate, în comparație cu 100,0% ± 8,4% pentru godeurile pretratate cu PEI (creștere de aproximativ 5 ori). Pretratarea cu colagen sau PDL a dus la inducții mai modeste (de aproximativ 2 până la 3 ori în figura 5B). Cea mai mică îmbunătățire a fost observată cu colagenul, în mod similar cu creșterea mai mică a atașării celulelor HEK-293 care a fost observată anterior în Figura 3B. În cele din urmă, pentru fibroblastele MYS care se atașează puternic, nu a existat un efect pozitiv semnificativ observat prin utilizarea factorilor de atașare în procedura de transfecție. Variațiile au fost de obicei mai mici de 20% pentru toate condițiile experimentale. Experimentul reprezentativ prezentat în figura 5C arată, de fapt, un randament de transfecție ușor mai mare pentru godeurile netratate decât pentru plăcile pretratate cu PEI (activitate relativă de 117,7 % ± 3,2 % pentru godeurile netratate față de 100,0 % ± 4,0 % pentru cele netratate).8% pentru godeurile pretratate cu PEI, sau un randament de transfecție de aproximativ 1,2 ori mai mare în cazul martorului).

Compilând rezultatele din toate experimentele efectuate, reducerea medie de ori (± deviația standard) observată în randamentul de transfecție a celulelor PC-12 ancorate pe PEI în comparație cu celulele de pe godeurile netratate a fost de 2.4 ori (± 0,1 ori; n = 3), în timp ce sporirea cu celulele HEK-293 a fost de 6,3 ori (± 0,5 ori; n = 2). Analiza statistică t-test indică faptul că ambele creșteri sunt semnificative (p < 0,05). Nu a fost observată nicio îmbunătățire semnificativă a transfecției în experimentele cu celule MYS, cu o schimbare medie de 1,0 ori (± 0,3 ori; n = 2) prin pretratarea cu PEI (practic identică cu randamentul fără tratament).