Koronavirustauti vuodelta 2019 (COVID-19) on infektiotauti, joka on aiheuttanut maailmanlaajuisen pandemian, jossa on sairastunut yli 36 miljoonaa tartunnan saanutta ihmistä noin 200:sta maasta tai alueelta, ja tähän mennessä yli miljoona ihmistä on kuollut (Maailman terveysjärjestö (WHO), 2020). COVID-19:n aiheuttajan, vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän koronaviruksen 2 (SARS-CoV-2), oletetaan olevan peräisin lepakoista, sillä lepakoiden levittämä koronavirus RaTG13 on toistaiseksi lähin geneettinen sukulainen (Andersen ym., 2020; Zhou ym., 2020). Useita lajeja on tutkittu niiden mahdollisen roolin määrittämiseksi väli-isäntinä (Shi et al., 2020). Lisäksi COVID-19:n kaltaista tautia toistavia eläinmalleja pidetään tärkeänä tutkimuslinjana, ja niitä tarvitaan terapeuttisten lääkkeiden ja ennaltaehkäisevien yhdisteiden kehittämiseksi.
Sen lisäksi, että useissa mallinnustutkimuksissa on ehdotettu mahdollisia SARS-CoV-2:lle alttiita eläinlajeja (Damas ym., 2020; Qiu ym., 2020; Veljkovic ym., 2020), useat kokeelliset infektiot ovat jo osoittaneet laajan kirjon alttiita eläimiä. Erityisesti egyptiläinen hedelmälepakko, fretti, kultainen syyrialainen hamsteri, kissa, hiiret, jotka ilmentävät humanisoitua angiotensiiniä konvertoivaa entsyymiä 2 (ACE2), BALB/c-hiiret (jotka käyttävät mutatoitua SARS-CoV-2:ta useilla soluviljelykierroksilla) ja jotkin kädellislajit ovat alttiita virusinfektiolle, ja niille kehittyy subkliinisestä lievään tai kohtalaiseen asteeseen etenevää hengitystie- ja verisuonitautia (Bao et al., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Kokeellisesta näkökulmasta katsottuna koirien alttius SARS-CoV-2:lle on rajallinen, sillä rokotetut eläimet voivat osittain serokonvertoitua (Shi et al., 2020). Sen sijaan kanan, ankan ja sian intranasaalinen rokottaminen ei johtanut näyttöön tartunnasta (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Sikaa käytetään yleisesti tutkimuksessa, koska se on anatomian, genetiikan, fysiologian ja myös immunologian osalta samanlainen kuin ihminen. Sioilla tehdyt kokeet ennustavatkin todennäköisesti paremmin terapeuttisia ja ennaltaehkäiseviä hoitoja ihmisillä kuin jyrsijöillä tehdyt kokeet (Meurens ym., 2012). Koska siat eivät kuitenkaan ole alttiita SARS-CoV-2-infektiolle, kun ne inokuloidaan intranasaalisesti (Schlottau ym., 2020; Shi ym., 2020), on tutkittava mahdollisuutta kehittää sikojen infektiomalli tämän viruksen kanssa käyttäen muita mahdollisia inokulaatioreittejä. Tärkein peruste sikojen testaamiselle on se, että tämän lajin ACE2-reseptori on toimiva joko transfektoimalla sian ACE2 HeLa-soluihin (jotka eivät ilmentä konstitutiivisesti ihmisen ACE2:ta) (Zhou ym., 2020) tai että SARS-CoV-2:n S-proteiinilla varustetut pseudopartikkelit pystyvät infektoimaan sikojen munuaissoluja (Letko ym., 2020). Lisäksi ACE2-proteiini ilmentyy kaikissa tärkeimmissä sikojen kudoksissa immunohistokemiallisesti arvioituna (Xiao et al., 2020). Tämän vuoksi tutkimme kotieläiminä pidettävien sikojen (Sus scrofa domesticus) SARS-CoV-2-inokulaation erilaisten luonnollisten ja ei-luonnollisten reittien vaikutusta kotieläiminä pidettävien sikojen (Sus scrofa domesticus) mahdollisen COVID-19-mallin luomiseksi.
Tarkoitusta varten valittiin neljä viiden 5-6-viikkoisen tavanomaisen porsaan (Landrace × Large White) ryhmää, jotka inokuloitiin eri reittejä käyttäen: intranasaalisesti (IN, 1,5 ml/nostoläpivienti; kokonaistilavuus 3 ml), intratrakeaalisesti (IT, 3 ml), kuten aiemmin on kuvattu (Garcia-Morante ym, 2016), lihaksensisäisesti (IM, 1 ml kaulalihaksen kummallekin puolelle; kokonaistilavuus 2 ml) tai laskimonsisäisesti (IV, 2 ml), jolloin lopullinen annos oli 105,8 kudosviljelyssä tarttuvaa annosta (TCID50) SARS-CoV-2-isolaattia (GISAID ID EPI_ISL_510689) kutakin eläintä kohti. IT- ja IV-ryhmät nukutettiin 10 mg/kg ketamiinilla ja 0,8 mg/kg ksylatsiinilla ennen inokulaatiota. Läpikäynti-2 SARS-CoV-2:ta lisättiin ja titrattiin Vero E6 -soluissa (ATCC CRL-1586) noudattaen samaa protokollaa kuin muille koronaviruksille (Rodon ym., 2019). Negatiivisina kontrolleina käytettiin kahta ylimääräistä sikaa.
Kaikki eläimet olivat seropositiivisia sikojen hengitystiekoronavirusta vastaan kaupallisella ELISA-testillä (INgezim Corona Diferencial 2.0 ) määritettynä. Ottaen huomioon, että alfa- ja beetakoronavirusten välillä ei ole kuvattu vasta-aineiden ristireaktiivisuutta (Okba ym., 2020), eläimet pidettiin tutkimuksessa. Alkuperäistä reaktiivisuutta PRCV:tä vastaan odotettiin, koska tämä virus on kaikkialla läsnä Euroopan sikakarjassa (Saif ym., 2012; Vidal ym., 2019).
Eläinkokeet hyväksyttiin Institutional Animal Welfare Committee of the Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) ja Katalonian autonomisen hallituksen eläinkokeiden eettisen toimikunnan toimesta, ja ne suoritettiin sertifioidun henkilöstön toimesta. Kokeet SARS-CoV-2:lla suoritettiin IRTA-CReSA:n bioturvallisuusyksikön bioturvallisuustason 3 (BSL-3) tiloissa (Barcelona, Espanja).
2 ja 22 päivää inokulaation jälkeen (dpi) kaksi ja kolme eläintä/ryhmä (IT, IM ja IV) lopetettiin. Koska IN-inokulaatio oli jo osoitettu tehottomaksi aiheuttamaan SARS-CoV-2-infektiota (Shi et al., 2020), tällä reitillä inokuloidut siat lopetettiin päivinä 1 ja 2 pi, jotta voitiin arvioida näyttöä mahdollisesta ohimenevästä varhaisesta infektiosta kudoksissa. Negatiiviset kontrollieläimet lopetettiin ennen kokeen aloittamista. Näytteet kerättiin ja käsiteltiin aiemmin kuvatulla tavalla (Vergara-Alert ym., 2017). Lyhyesti sanottuna kaikille eläimille tehtiin täydelliset nekrosiat. Useita kudoksia (frontaalinen, mediaalinen ja kaudaalinen turbinaatti; proksimaalinen, mediaalinen ja distaalinen henkitorvi; iso ja pieni keuhkoputki, vasen kraniaalinen, mediodorsaalinen ja kaudaalinen keuhkoalue; munuainen; maksa; sydän; ja perna) otettiin, kiinnitettiin upottamalla 10 %:iin neutraalipuskuroituun formaliiniin, upotettiin parafiiniin ja leikattiin leikkauskappaleiksi 3 µm:n paksuudelta objektiolevyjen valmistamiseksi. Histologiset objektilasit värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) mahdollisten mikroskooppisten vaurioiden arvioimiseksi. Lisäksi samat kudokset sekä ileum, kaulan imusolmuke (LN), mediastinaalinen LN, mesenteriaalinen LN, hajulohko, nielurisat, kateenkorva, parotis-sylkirauhanen, lisämunuainen, haima, aivorunko, silmäluomet ja luuydin otettiin myös Dulbecco’s modifioidussa Eagle-mediassa (DMEM) putkissa, joissa oli helmiä, SARS-CoV-2 upE-geenin havaitsemiseksi RT-qPCR:llä (Corman et al., 2020). Lisäksi otettiin nenän ja peräsuolen pyyhkäisynäytteet (päivittäin ensimmäisen viikon aikana sekä 14 ja 22 dpi:n kohdalla), jotta niistä voitiin analysoida viruksen RNA:ta edellä mainitulla RT-qPCR-menetelmällä. Päivinä 0, 14 ja 22 pi kerätyistä seeruminäytteistä tutkittiin SARS-CoV-2:n piikkien S1 + S2 ja nukleokapsidien (N) proteiinien vasta-aineiden esiintyminen talon omilla ELISA-testeillä (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Myös viruksen neutralisaatiomääritys tehtiin aiemman protokollan mukaisesti pienin muutoksin (Rodon et al., 2020), seerumien ja SARS-CoV-2:n sarjalaimennoksia inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ennen levymäärityksen suorittamista.
Kaikkia eläimiä seurattiin päivittäin, mutta yhdelläkään niistä ei ilmennyt kliinisiä oireita SARS-CoV-2-inokulaation jälkeen. Myöskään SARS-CoV-2-infektiosta johtuvia karkea- tai mikroskooppisia vaurioita ei havaittu yhdelläkään tutkituista eläimistä kaikissa rokotus- ja kontrolliryhmissä (tietoja ei ole esitetty).
Viruksen RNA:ta ei irronnut yhdestäkään sioista nenästä tai peräsuolesta. Yhden IN-rokotetun eläimen proksimaalinen henkitorvi oli positiivinen viruksen RNA:n suhteen 1 dpi:n kohdalla (Cq = 24,36). Muut kudokset tästä eläimestä ja muista sioista olivat negatiivisia RT-qPCR:llä (qPCR:n havaitsemisraja 38,6 sykliä).
14 ja 22 dpi:n kohdalla kaikissa IM- ja IV-ryhmiin kuuluvissa eläimissä voitiin havaita alhaisia pitoisuuksia Spike-proteiinia vastaan suunnattuja vasta-aineita (kuva 1a). Lisäksi näillä sioilla havaittiin neutraloivia vasta-ainetittereitä 22 dpi (vaihtelivat 74:stä 317:ään SNT50-rekisteröintitiitteriin) (kuva 1b). Lisäksi yhdestä kolmesta IM-eläimestä ja kaikista IV-rokotetuista eläimistä löytyi kokeen loppuun mennessä alhainen N-proteiiniin kohdistuva vasta-ainepitoisuus (tietoja ei ole esitetty). Tärkeää on, että yhdellä IT-ryhmän eläimellä ei ollut vasta-aineita S-proteiinia vastaan, mutta sillä oli vasta-aineita N-proteiinia vastaan ja neutraloivia tittereitä (SNT50-riippuvainen laimennustitteri 29) päivänä 0 pi, mikä saattaa viitata mahdolliseen ristireaktioon jonkin toisen sikoja infektoivan koronaviruksen kanssa. Huomattakoon, että nämä N-proteiinia vastaan olevat vasta-aineet vähenivät kokeen päättyessä, mikä viittaa siihen, että ne olivat peräisin emolta. Lisäksi tällä eläimellä ei ollut seroneutralisoivia vasta-aineita 22 dpi:n aikana (kuva 1b).
Tämänhetkiset tiedot osoittavat, että SARS-CoV-2 ei kyennyt tartuttamaan sikoja millään testatuista reiteistä, nimittäin IN:llä, IT:llä, IM:llä ja IV:llä. Näin ollen pyrkimyksemme vahvistavat aiemmat kokeet, jotka osoittavat, ettei sika ole altis tartunnalle (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), vaikka sitä voidaan käyttää tulevien rokotekandidaattien immunogeenisuuden arviointiin.
Tärkeää on, että tämä tutkimus menee muita SARS-CoV-2:lla ja sioilla tehtyjä tutkimuksia pidemmälle, koska testasimme laajemman määrän rokotusreittejä. Mikään niistä ei kuitenkaan johtanut tuottavaan infektioon porsaissa. Merkittävä tulos tässä tutkimuksessa oli todisteet serokonversiosta Spike-glykoproteiinia vastaan 14. ja 22. päivänä pi ja neutraloivien vasta-aineiden esiintymisestä 22. päivänä pi sioilla, jotka oli rokotettu parenteraalisesti (IM ja IV). Kun otetaan huomioon kokeen lyhyt kesto (22 päivää), tällainen serokonversio korostaa sikojen mahdollista kiinnostavuutta SARS-CoV-2:n immunogeenisuustutkimuksissa. Itse asiassa sian kiinnostavuus soveltuvana eläinmallina immunologian, fysiologian, farmakologian ja kirurgian tutkimukseen, jota voidaan soveltaa ihmislääketieteeseen, on laajalti tunnustettu (Rothkötter, 2009).
Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa vahvistetaan, että porsaat eivät ole sopiva eläinmalli COVID-19:lle, mutta niiden mahdollinen käyttökelpoisuus immunogeenisuuden mallina prekliinisissä rokotekehitystutkimuksissa ansaitsee lisätutkimuksia.