4-1BB/4-1BBL-interaktion främjar fetmainducerad fettinflammation genom att utlösa dubbelriktad inflammatorisk signalering i adipocyter/makrofager

Abstract

Fetmainducerad fettinflammation kännetecknas av rekrytering av makrofager till fettvävnaden och frisättning av inflammatoriska cytokiner. 4-1BB, en kostimulerande receptor, modulerar inflammatoriska processer genom interaktion med sin ligand 4-1BBL på immuncellsytor. I den här studien undersökte vi om en 4-1BB/4-1BBL-interaktion mellan adipocyter och makrofager deltar i fetmainducerad fettinflammation. Vi fann att 4-1BB uttrycktes på adipocyter och uppreglerades av fetmarelaterade faktorer, vilket också ökade 4-1BBL-uttrycket på makrofager. 4-1BB- och/eller 4-1BBL-agonister respektive aktiverade inflammatoriska signalmolekyler (MAPK/IκBα och MAPK/Akt) i adipocyter och makrofager och ökade frisättningen av inflammatoriska cytokiner (MCP-1, TNF-α och IL-6). Dessutom minskade störning av 4-1BB/4-1BBL-interaktionen frisättningen av inflammatoriska cytokiner från kontaktkokulturerade adipocyter/makrofager. Dessa resultat tyder på att 4-1BB/4-1BBL-medierad dubbelriktad signalering i adipocyter/makrofager främjar fettinflammation. 4-1BB och 4-1BBL kan vara användbara mål för skydd mot fetmainducerad fettinflammation.

1. Introduktion

Fetmainducerad inflammation anses vara en potentiell orsak till metaboliska störningar såsom insulinresistens, typ 2-diabetes och kardiovaskulära sjukdomar . Fettvävnad deltar aktivt i fetmainducerad inflammation genom rekrytering av makrofager och T-celler och frisättning av inflammatoriska cytokiner (monocytkemotaktiskt protein-1, MCP-1; tumörnekrosfaktor alfa, TNF-α; interleukin-6, IL-6) som modulerar adipocytdifferentiering, metabolism och lokala/systemiska inflammatoriska reaktioner, vilket orsakar oönskade metaboliska obalanser . Intressant nog har nyligen genomförda studier visat att direktkontaktsodling av adipocyter och makrofager resulterar i en markant förhöjd frisättning av inflammatoriska cytokiner , vilket tyder på att interaktionen mellan cellytemolekyler på dessa celler är viktig för att främja deras inflammatoriska reaktioner.

4-1BB (även känd som CD137 och TNFRSF9) är ett klassiskt exempel på en kostimulerande molekyl och en välkänd inflammatorisk receptor som uttrycks av aktiverade T-celler vid inflammationsställen . Stimulering av 4-1BB på T-celler leder till celexpansion, cytokinproduktion och utveckling av cytolytiska effektorfunktioner . 4-1BB-ligand (4-1BBL, även känd som CD137L och TNFSF9) uttrycks i hög grad av de flesta immunceller och många icke-immuna celler och kan ta emot och överföra omvända signaler till celler som makrofager . Allt fler bevis visar att dubbelriktade 4-1BB/4-1BBL-interaktioner på cellytan i immunceller är avgörande för att initiera och modulera olika inflammatoriska reaktioner (t.ex. reumatoid artrit, autoimmun myokardit och hematologiska maligniteter) . Dessutom förekommer 4-1BB/4-1BBL-medierade interaktioner även mellan immunceller och icke-immuna celler, vilket återigen påverkar inflammatoriska reaktioner. Interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL på endotelceller och makrofager är till exempel involverad i vaskulär inflammation , och interaktionen mellan de två molekylerna på epitelceller och naturliga mördarceller är involverad i ischemi-reperfusionsskador i njurarna . Vi har tidigare visat att uttrycket av 4-1BB och 4-1BBL var uppreglerat i fettvävnad som var inflammerad på grund av fetma, och att ablation av 4-1BB minskade fettinflammation . Därför antog vi att interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL på fettceller och immunceller som makrofager spelar en roll för fettinflammation vid fetma.

I denna studie visar vi för första gången att 4-1BB uttrycks på adipocyter och uppregleras av fetmarelaterade faktorer, och vi visar att 4-1BB/4-1BBL-medierad dubbelriktad signalering i adipocyter/makrofager spelar en avgörande roll för att initiera och främja den fetmainducerade inflammatoriska fettinflammationskaskaden.

2. Material och metoder

2.1. Djur

C57BL/6-möss (hanar, 8 veckor gamla) (Orient Ltd., Busan, Korea) utfodrades med en diet med hög fetthalt (HFD, 60 % av kalorierna från fett (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA); överviktiga möss) eller med en diet med låg fetthalt (LFD; 10 % av kalorierna från fett (Research Diets); icke överviktiga möss) i 9 veckor. Alla djurförsök godkändes av den djuretiska kommittén vid universitetet i Ulsan och överensstämde med riktlinjerna från National Institutes of Health.

2.2. Antikroppar

Nude möss primas med pristan och injicerades intraperitonealt med ett subklonat hybridom som producerar en agonistisk monoklonal antikropp (Ab) mot 4-1BB (3E1) för att framkalla ascitbildning . Det monoklonala Ab renades från ascitesvätskan genom affinitetskolonnkromatografi med protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Rekombinant 4-1BB Fc (r4-1BB Fc) köptes från Adipogen (Seoul, Korea). Antagonistiskt monoklonal Ab mot 4-1BBL (TKS-1) köptes från e-Bioscience (San Diego, CA, USA). Immunoglobulin G från råtta (Rat IgG) och IgG1 från människa köptes från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) och användes som kontroll.

2.3. Cellkulturer och behandlingar

Den murina makrofagcelllinjen Raw264.7 erhölls från Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seoul, Korea). Denna cellinje bibehölls i RPMI1640 (Gibco BRL, NY, USA) innehållande 10 % (vol/vol) FBS (fetalt bovint serum) (Gibco BRL, NY, USA) och inkuberades vid 37 °C i fuktat tillstånd med 5 % CO2. 3T3-L1 preadipocyter hölls i DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) med hög glukoshalt (Gibco BRL, NY, USA) innehållande 10 % FBS. Konfluenta 3T3-L1 preadipocyter (dag 0) inkuberades i DMEM som innehöll 10 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (dexametason, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-isobutyl-1-metyl-xantin, Sigma-Aldrich) och 10 % FBS i 2 dagar. Kortfattat differentierades 3T3-L1-celler till mogna adipocyter genom inkubation i DMEM med 10 % FBS och 5 μg/mL insulin i 2 dagar. Mogna adipocyter bibehölls i detta medium, och odlingsmediet ersattes med nytt medium varannan dag. Fri fettsyra (FFA, palmitinsyrablandning, Sigma-Aldrich) löstes i etanol som innehöll bovint serumalbumin (BSA, 25 μM) och konjugerades med BSA i molförhållandet 10:1 före användning. 3T3-L1 adipocyter (3 × 105 celler/brunn) eller Raw264.7-makrofager (3 × 105 celler/brunn) i 24-hålsplattor behandlades med fetmarelaterade faktorer (palmitinsyra : pal, lipopolysackarid : LPS) i 24 timmar respektive 4 timmar. För att stimulera 4-1BB på adipocyter inkuberades 3T3-L1 adipocyter på 24-hålsplattor med agonistiskt 4-1BB Ab (3E1, 1 μg/mL) eller rått-IgG i 48 h i serumfritt medium. För att immobilisera r4-1BB Fc eller humant IgG1 på odlingsplattor inkuberades r4-1BB Fc eller humant IgG1 i 24-hålsplattor vid 37 °C i 1 timme i en koldioxidinkubator och brunnarna sköljdes med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Plattorna inkuberades sedan med RPMI (10 % FBS) vid 37 °C i 1 timme i en koldioxidinkubator och brunnarna sköljdes med PBS. Rå264.7-makrofager inkuberades med 5 × 105 celler/brunn i 24-håls plattbottnade plattor med förbeläggning med 100 ng/mL r4-1BB Fc eller humant IgG1 i 24 timmar.

2.4. Isolering av stromala kärlceller från fettvävnad

För att isolera den stromala kärlfraktionen (SVF) från fettvävnad hackades epididymiala fettkuddar från C57BL/6-möss (hanar, 8 veckor gamla) och smältes i 30 minuter vid 37 °C med typ 2-kollagenas (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) i DMEM (pH 7,4). De resulterande suspensionerna centrifugerades vid 500 g i 5 minuter. Pelleterna återuppsattes i erytrocytlysisbuffert och suspensionerna inkuberades i rumstemperatur i 3 minuter, varefter de centrifugerades vid 500 g i 5 minuter. Efter tvätt i DMEM passerade suspensionerna genom sterila 100 μm nylonnät (SPL Lifescience, Pocheon, Korea). De filtrerade cellerna överfördes till 100 mm2 skålar som innehöll DMEM kompletterat med 10 % FBS och 0,4 % Fungizone och förvarades i en inkubator vid 37 °C i 5 % CO2. Cellerna fick fästa och flytande celler avlägsnades genom aspiration och odlingsmediet fylldes på varje dag. SVF-cellerna samlades in efter två dagar. SVF-cellerna pläterades med 5 × 105 celler/brunn i 24-hålsplattor. De konfluenta SVF-avledda preadipocyterna differentierades till adipocyter genom behandling med DMEM innehållande 10 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) och 10 % FBS i 2 dagar. Mogna adipocyter hölls i kulturmediet som ersattes med nytt medium varannan dag. För att detektera 4-1BB- och 4-1BBL-uttryck på SVF-deriverade adipocyter som utsätts för fetmafaktorer, inkuberades dessa celler med palmitinsyra 250 μM, LPS 100 ng/mL i 24 timmar.

2.5. Isolering av peritoneala makrofager

C57BL/6-möss (hanar, 8 veckor gamla) injicerades intraperitonealt med 3 ml 3 % tioglykollatbuljong (Difco, Detroit, MI, USA) 4 dagar innan de avlivades. Peritoneala makrofager samlades in genom centrifugering i MEM-medium (Minimum Essential Medium, Gibco) och den resulterande pelletsen tvättades och återuppsattes i kulturmedium MEM med 10 % FBS. De peritoneala makrofagerna renades genom att de adhererade på vävnadskulturplattor i 2 timmar. För att detektera 4-1BB- och 4-1BBL-uttryck på peritoneala makrofager som exponerats för fetmafaktorer, inkuberades dessa celler med palmitinsyra 250 μM, LPS 100 ng/mL i 4 timmar.

2.6. Samodling av adipocyter och makrofager

3T3-L1 adipocyter odlades och differentierades i 6 dagar. Kokultur av adipocyter och makrofager utfördes med två metoder: kokultur med direktkontakt och transwellkokultur. I direktkontaktsystemet placerades Raw264.7-makrofager (3 × 105 celler: 50 % makrofager, 3 × 104 celler: 10 % makrofager) eller peritoneala makrofager (3 × 105 celler) i 24-hålsplattor som innehöll 3T3-L1 adipocyter (3 × 105 celler). Cellerna odlades i 24 timmar i kontakt med varandra och skördades sedan. Som kontroll odlades adipocyter och makrofager också separat, med samma antal celler per brunn som i kontaktsystemet, och de blandades efter skörd. I transwell-systemet samodlades cellerna med hjälp av transwell-insatser med ett 0,4 μm poröst membran (Corning, NY, USA) för att separera adipocyter (3 × 105 celler, nedre brunn) från makrofager (3 × 105 celler, övre brunn). Efter inkubation i 4 timmar, 8 timmar och 12 timmar skördades supernatanterna.

2.7. Mätning av cytokinnivåer

Cytokinnivåerna i odlingssupernatanterna mättes med hjälp av enzymkopplade immunosorbentanalyser (ELISA). Testerna utfördes med hjälp av OptEIA mus TNFα, en uppsättning mus MCP-1 (BD Bioscience Pharmingen, CA, USA) och en uppsättning mus IL-6 och adiponectin (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) samt IL-10-kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Värden för cytokinnivåer härleddes från standardkurvor med hjälp av kurvanpassningsprogrammet SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

2.8. Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

Total RNA som extraherades från odlade celler transkriberades omvänt för att generera cDNA med hjälp av M-MLV omvänt transkriptas (Promega, Madison, WI, USA). Realtids-PCR-amplifiering av cDNA utfördes i två exemplar med ett SYBR premix Ex Taq-kit (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, USA) med hjälp av en Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japan). Alla reaktioner utfördes enligt samma procedur: inledande denaturering vid 95 °C i 10 s, följt av 45 cykler vid 95 °C i 5 s och 60 °C i 30 s. Alla värden för gener av intresse normaliserades till värden för hushållsgener (36B4 för adipocyter; β-actin för makrofager och kokulturer). De primersekvenser för mus som användes visas i tabell 1.

Gen Förward primersekvens Reverse primersekvens 4-1BB CTCTCTGTGCTCAAATGGATCAGGAA TGTGGACATCGGCAGCTACAA 4-1BBL CCTGTGTTCGCCAAGCTACTG CGGGACTGTCTACCACCAACTC MCP-1 GCATCCACGGTGTTGGCTCA CTCCAGCCCCTACTCATTGGGATCA TNF- AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTTTG IL-6 CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA GCAAGTGCATCATCGTTGTTGTTCATAC 36B4 TGTGTGTGTCTGCAGATCGGGTAC CTTTGGCGGGATTAGTCGAAG -aktin CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC ATGGAGCCACACCGATCCACA

Tabell 1

Sekvenserna för de primers för mus som användes för qRT-PCR-analys.

Data analyserades med hjälp av Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.). Relativa standardkurvor genererades genom att plotta cykeltröskelvärdena (Ct). Baserat på de Ct-värden som erhållits från varje prov beräknades de relativa mängderna av målgener med hjälp av standardkurvorna med programvara som tillhandahålls av Takara Thermal Cycler Dice Real Time System.

2.9. Separering av adipocyter och makrofager

Kokulturerade 3T3-L1 adipocyter och Raw264.7 makrofager i lika stort antal (enligt tidigare beskrivning) separerades enligt tillverkarens protokoll med hjälp av CD11b MicroBeads-systemet (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA). Kortfattat samlades samkulturerade celler upp, tvättades två gånger med buffert (PBS kompletterat med 2 mM EDTA och 0,5 % bovint serumalbumin-BSA) och inkuberades med CD11b-mikrokorn i 15 minuter vid 4°C. Tvättade och resuspenderade celler applicerades på MACS-kolonnen, som höll kvar CD11b+-celler och lät negativa celler (adipocyter) passera igenom. Kolonnen avlägsnades sedan från separatorn och placerades på ett lämpligt uppsamlingsrör. Lämpliga mängder kolonnbuffert pipetterades på kolonnen för att spola ut positiva celler (makrofager) med hjälp av en kolvleverantör med kolonnen. Denna metod resulterade i 90-95 % rena CD11b+-celler, vilket utvärderades med flödescytometri.

2.10. Flödescytometri (FACS)-analys

3T3-L1 adipocyter och Raw264.7 makrofager som behandlats med fetmarelaterade faktorer (enligt tidigare beskrivning) trypsiniserades försiktigt, tvättades två gånger i PBS och inkuberades med Fcγ-receptorblockerande antikroppar (24G2) i 10 minuter på is, varefter de färgades med fykoerythrin (PE) konjugerat anti-4-1BB (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-4-1BBL (eBioscience) eller anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) och anti-CD11b (eBioscience) som kontroll för att definiera grinden för adipocyter/makrofager. Cellerna tvättades sedan med FACS-buffert och analyserades på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med programvaran CellQuest (BD Biosciences). Siffrorna i graferna anger andelen positiva celler.

2.11. Western Blot-analys

3T3-L1 adipocyter plattades ut på 1 × 106 celler/brunn i 6-brunnsplattor och inkuberades med 3E1 (1 μg/mL) eller rått-IgG i 3 h. Raw264.7-makrofager plattades ut på 1 × 106 celler/brunn i 6-brunnsplattor belagda med r4-1BB Fc eller humant IgG i 1 h. De 3E1-behandlade adipocyterna och de r4-1BB Fc-behandlade makrofagerna sköljdes med PBS, resuspenderades genom skrapning i lysisbuffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5 % deoxycholat, 1 % IGEPAL och en proteashämmarecocktail) och centrifugerades vid 3 000 rpm i 5 minuter. Prover som innehöll 10-30 μg totalt protein utsattes för western blot-analys med hjälp av polyklonala antikroppar mot fosforylerat IKK (I kappa B kinas alfa/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), totalt IKKβ, p-p38 MAPK (mitogenaktiverat proteinkinas), p-JNK (c-Jun aminoterminalt kinas), totalt JNK, p-Akt (proteinkinas B; Ser473), totalt Akt (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) och IκBα (inhibitor of nuclear factor-κB alpha; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) samt β-actin (Sigma).

2.12. Statistisk analys

Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM av tre oberoende utförda i två exemplar. Statistiska jämförelser utfördes med hjälp av Students -test eller ANOVA med Duncans multipla intervalltest. Skillnader ansågs vara signifikanta vid .

3. Resultat

3.1. Uttryck av 4-1BB och 4-1BBL i adipocyter/makrofager och fettvävnad

Vi mätte först uttrycket av 4-1BB under adipogenesen på mRNA-nivå med qRT-PCR. Vi fann att nivåerna av 4-1BB-transkript var högre i SVF-deriverade adipocyter efter differentiering (figur 1(a)). Viktigt är att fetmarelaterade ämnen som palmitinsyra och LPS signifikant uppreglerade nivåerna av 4-1BB-transkriptioner i SVF-deriverade adipocyter och 4-1BBL-transkriptioner i peritoneala makrofager (figur 1(b)). Uppregleringen av transkriptionerna bekräftas i 3T3-L1 adipocyter och/eller Raw264.7-makrofager (figur 1(c)). FACS-analysen visade också att 4-1BB-protein på 3T3-L1 adipocyter och 4-1BBL-protein på Raw264.7-makrofager (figur 1(d)) ökade av dessa fetmarelaterade faktorer. Dessutom ökade 4-1BB- och 4-1BBL-transkriptionerna i kokulturerade adipocyter/makrofager (figur 1(e)) samt i epididymal fettvävnad hos överviktiga möss som fått HFD (figur 1(f)).

3.2. Frisättning av inflammatoriska cytokiner och aktivering av inflammatoriska signalmolekyler genom 4-1BB- och 4-1BBL-stimulering i adipocyter och makrofager, respektive

För att undersöka om 4-1BB på adipocyter eller 4-1BBL på makrofager ger en inflammatorisk signal behandlade vi varje celltyp med agonister som specifikt stimulerar dessa molekyler; 3T3-L1 adipocyter behandlades med en agonistisk 4-1BB-antikropp (3E1) i 48 timmar och Raw264.7 makrofager med r4-1BB-Fc under 24 h och vi mätte sedan nivåerna av inflammatoriska cytokiner i respektive celler. Både 4-1BB-stimulering av adipocyter och 4-1BBL-stimulering av makrofager ökade markant produktionen av proinflammatoriska cytokiner som MCP-1, TNF-α och IL-6 på mRNA- (figurerna 2(a) och 2(c)) och proteinnivå (figurerna 2(b) och 2(d)). Adiponectinutsöndringen från adipocyter förändrades inte av 4-1BB-stimulering (data visas inte). 4-1BBL-stimulering av makrofager minskade transkriptionerna av IL-10 (figur 2(c)), men ingen förändring observerades i IL-10-proteinfrisättning (figur 2(d)).

Figur 2

4-1BB- eller 4-1BBL-stimulering ökar frisättningen av olika inflammatoriska cytokiner från adipocyter eller makrofager. 3T3-L1 adipocyter och Raw264.7 makrofager behandlades med 1 μg/mL 3E1 respektive 100 ng/mL r4-1BB Fc under 48-24 h. MCP-1, TNF-α, IL-6 och IL-10 transkript och proteiner mättes sedan i 3T3-L1 adipocyter (a-b) och Raw264.7 makrofager (c-d). Fosforyleringen av IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt och β-actin mättes genom västerblotting. 3T3-L1 adipocyter inkuberades med 1μg/mL 3E1 i 3 h (e) och Raw264.7-makrofager med 100 ng/mL r4-1BB Fc i 1 h (f). Resultaten av densitometri visades i procent av kontrollen. Data är medelvärde ± SEM av tre oberoende experiment utförda i två exemplar. ; ; ; ; (jämfört med kontroll).

För att förstå de molekylära mekanismerna genom vilka 4-1BB och/eller 4-1BBL aktiverar inflammatorisk signalering i adipocyter och/eller makrofager, undersökte vi effekterna av 4-1BB/4-1BBL-stimulering på intracellulära signalmolekyler. Stimulering av 4-1BB på adipocyter ökade fosforyleringen av p38 MAPK och JNK samt fosforyleringen av IKK, NF-κB:s uppströmsmolekyl, och inducerade nedbrytning av IκBα (figur 2(e)), medan stimulering av 4-1BBL ökade fosforyleringen av Akt och p38 MAPK samt JNK (figur 2(f)), men hade ingen effekt på nedbrytningen av IκBα-protein (figur 2(f)) och fosforyleringen av IKK (data inte visat). I överensstämmelse med tidigare rapporter , 4-1BBL-signalering aktiverade inte bara p38 MAPK utan inducerade också Akt-aktivering i makrofager, vilket ledde till ökat uttryck av inflammatoriska cytokiner.

3.3. Utsöndring av inflammatoriska cytokiner i ett kontaktkoodlingssystem

Eftersom 4-1BB/4-1BBL-stimulering ökade utsöndringen av inflammatoriska cytokiner från adipocyter och/eller makrofager, respektive, undersökte vi om cell-cellinteraktion via ytmolekyler, förmodligen 4-1BB/4-1BBL, spelar en roll för att initiera och utlösa inflammatoriska reaktioner. Vi kokulturerade först 3T3-L1 adipocyter och Raw264.7-makrofager i ett direktkontaktsystem och fann att produktionen av inflammatoriska cytokiner IL-6, MCP-1 och TNF-α korrelerade med antalet makrofager i kulturen (figurerna 3(a)-3(c)) och ökade med tiden (figurerna 3(d)-3(f)).

3.4. Effekt av störning av interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL på frisättning av inflammatoriska cytokiner i ett kontaktkokultursystem

För att testa om den 4-1BB/4-1BBL-medierade interaktionen mellan adipocyter och makrofager deltar i den inflammatoriska reaktionen i de kontaktkokulturerade 3T3-L1 adipocyterna/Raw264.7-makrofagerna, blockerade vi interaktionen med hjälp av en neutraliserande antikropp (TKS-1). Den neutraliserande monoklonala antikroppen reagerar specifikt med mus 4-1BBL, varigenom 4-1BBL inte kan binda till 4-1BB-receptorn och kan avbryta interaktionen mellan 4-1BBL och 4-1BB. Därför kan både 4-1BB-medierad signal i adipocyter och 4-1BBL-medierad signal i makrofager avtrubbas av TKS-1-behandling. Vi fann att behandling med TKS-1 signifikant minskade nivåerna av IL-6, MCP-1 och TNF-α mRNA i kontaktkokulturerade adipocyter/makrofager (figur 4(a)). Minskningen av uttrycket av dessa inflammatoriska cytokiner bekräftades på proteinnivå (figur 4(b)). Dessutom fann vi också att störning av interaktionen mellan 4-1BB och 4-1BBL minskade frisättningen av inflammatoriska cytokiner från peritoneala makrofager som kokultiverats med adipocyter (figur 4(c)). För att undersöka de relativa bidragen från 4-1BB- och 4-1BB-signalering till inflammatoriskt genuttryck i de kokulturerade adipocyterna/makrofagerna separerade vi makrofagerna från adipocyterna och mätte nivåerna av transkript av inflammatoriska cytokiner i de två celltyperna (figur 4(d)). Den neutraliserande antikroppen minskade signifikant ökningen av nivåerna av IL-6, MCP-1 och TNF-α mRNA i adipocyterna såväl som i makrofagerna (figur 4(e) och 4(f)).

4. Diskussion

Fetmakinflammation som induceras av fetma kännetecknas av att makrofager rekryteras till fettvävnaden, och makrofagerna är en viktig källa till inflammatoriska svar. Cell-cellkontakt mellan adipocyter och makrofager anses vara viktig för att utlösa inflammatoriska vägar i fettvävnad , även om det är oklart vilka molekyler som är inblandade. Nya studier har visat att samstimulerande receptor 4-1BB och dess ligand 4-1BBL genom cellcellskontakt modulerar olika inflammatoriska reaktioner. I tidigare arbete fann vi att 4-1BB-brist minskade fettinflammation genom att minska rekryteringen av makrofager och frisättningen av inflammatoriska cytokiner . Baserat på dessa resultat antog vi att 4-1BB/4-1BBL-medierad cellcellsinteraktion mellan fettceller och makrofager kan vara viktig för uppkomsten och/eller upprätthållandet av fetmainducerad fettinflammation. Intressant nog var 4-1BB-transkriptioner i adipocyter och 4-1BBL-transkriptioner i makrofager tydligt uppreglerade av fetmarelaterade faktorer (t.ex. FFA och LPS), och deras uttryck ökade också kraftigt i kontaktkoodulerade adipocyter/makrofager. Uppregleringen av dessa molekyler åtföljdes dessutom av en ökad frisättning av inflammatoriska cytokiner från cellerna. Dessa fynd tillsammans med uppregleringen i fet fettvävnad och minskningen av fettinflammation hos 4-1BB-deficienta, feta möss tyder på att 4-1BB och 4-1BBL deltar i uppkomsten och/eller främjandet av inflammatoriska reaktioner inducerade av adipocyter/makrofager.

För att se om 4-1BB på adipocyter eller 4-1BBL på makrofager var ansvariga för de inflammatoriska signaler som utlöste inflammatoriska reaktioner, stimulerade vi cellerna med agonister som binder specifikt till antingen 4-1BB eller 4-1BBL. Vi fann för första gången att stimulering av 4-1BB på adipocyter markant ökade frisättningen av de inflammatoriska cytokinerna MCP-1, TNF-α och IL-6. Stimulering av 4-1BBL-medierad omvänd signalering, som är känd för att aktivera makrofager , ökade också nivåerna av inflammatoriska cytokiner. Nya bevis tyder på att 4-1BB-signalering resulterar i aktivering av MAPK/NF-κB-vägen, som är TNF-receptorassocierad faktor (TRAF)-2-beroende i lymfocyter . I adipocyter fann vi att stimulering av 4-1BB aktiverade p38 MAPK, JNK, IKK och inducerade IκBα-proteinnedbrytning. Å andra sidan ledde stimulering av 4-1BBL till aktivering av inflammatoriska signalmolekyler som Akt och p38 MAPK i makrofager, vilket överensstämmer med tidigare studier . Ännu viktigare är att vi fann att behandling med en 4-1BBL-neutraliserande antikropp minskade frisättningen av inflammatoriska cytokiner i kokulturer på både mRNA- och proteinnivå. Dessa resultat tyder tillsammans på att den 4-1BB/4-1BBL-medierade interaktionen mellan adipocyter och makrofager utlöser dubbelriktad inflammatorisk signalering och är en potent inducerare av inflammatoriska reaktioner i fet fettvävnad (figur 5).

Figur 5

Schematisk framställning av den dubbelriktade signaltransduktionen som induceras av 4-1BB/4-1BBL-medierad interaktion mellan adipocyter och makrofager. Frisättningen av inflammatoriska cytokiner (MCP-1, TNF-α och IL-6) som svar på den dubbelriktade signaleringen tycks delta i fettinflammation.

Interessant nog undertryckte avbrott i 4-1BB/4-1BBL-interaktionen inte helt frisättningen av inflammatoriska cytokiner från samodlade adipocyter och makrofager. Detta kan bero på förekomsten av andra cellytemolekyler som deltar i cell-cellinteraktioner och förmedlar inflammatoriska reaktioner. Adipocyter och makrofager uttrycker många inflammatoriska receptorer och ligander på sina ytor. Till exempel anses CD40 och Herpes virus entry mediator (HVEM), som uttrycks på adipocyter, vara mediatorer för kontaktberoende signalering av makrofager, och ablation av dessa receptorer minskar fetmainducerade inflammatoriska reaktioner . Det är därför tänkbart att andra receptorer och ligander utöver 4-1BB och 4-1BBL också är involverade i interaktionen mellan adipocyter och makrofager som leder till initiering och upprätthållande av inflammatoriska reaktioner.

Sammanfattningsvis har vi för första gången visat att den kontaktberoende interaktionen mellan adipocyter och makrofager som förmedlas av 4-1BB och 4-1BBL, som genererar dubbelriktade signaler, spelar en avgörande roll för frisättningen av inflammatoriska cytokiner från dessa celler. 4-1BB och 4-1BBL, tillsammans med andra molekyler som är involverade i cellcellsinteraktionen mellan adipocyter och makrofager, kan vara värdefulla måltavlor för att förhindra fetmainducerad fettinflammation.

Interessentkonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av forskningsprogrammet Midcareer genom National Research Foundation (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finansierat av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (MEST), och Science Research Center-programmet (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) av NRF of Korea, finansierat av MEST.