5-hydroximetylcytosin och dess potentiella roll i utveckling och cancer

Den dubbla rollen för 5-hydroximetylcytosin som en stabil DNA-bas och som en intermediär i DNA-demetylering

Vi vet nu att 5hmC-nivåerna varierar avsevärt mellan olika celltyper och vävnader och att de är högst i hjärnan, i synnerhet i nervceller. Eftersom 5hmC är en oxidationsprodukt av 5mC är det uppenbart att bildandet av 5hmC från 5mC automatiskt sänker nivåerna av 5mC vid varje given nukleotidposition eller till och med i hela genomet. Därför var det omedelbart uppenbart att omvandlingen av 5mC till 5hmC skulle kunna vara det första steget i en väg som leder till DNA-demetylering. Det finns bevis från olika experimentella system för att detta verkligen kan vara fallet . Slutresultatet av denna demetyleringsväg är passivt eller aktivt avlägsnande av den modifierade basen och/eller försvinnande av metylgruppen från cytosin i DNA (figur 1). I den passiva demetyleringsvägen kan 5hmC inte kopieras av underhålls-DNA-metyltransferaset DNMT1, ett enzym som sprider redan existerande metyleringsmönster och verkar på hemimetylerade CpG-platser . Den aktiva demetyleringsprocessen som använder 5hmC som mellanprodukt är betydligt mer komplicerad. Enligt en rapport kan 5hmC omvandlas till cytosin av DNA-metyltransferaser . Deaminering av 5hmC ger upphov till 5-hydroximetyluracil , som kan avlägsnas av basexcisionsreparationsenzymer, bland annat tymin-DNA-glykosylas (TDG) och enkelsträngsselektivt monofunktionellt uracil-DNA-glykosylas (SMUG1) . Det är dock för närvarande okänt hur effektivt en sådan väg fungerar in vivo. Stegvis oxidation av 5hmC av TET-proteiner producerar 5-formylcytosin (5fC) och sedan 5-carboxylcytosin (5caC) . Detta 5caC, som kan påvisas i låga halter i DNA, kan sedan avlägsnas antingen genom basexcisionsreparation som katalyseras av DNA-glykosylasaktiviteten hos proteinet TDG , eller genom dekarboxylering. Teoretiskt sett borde dekarboxyleringsvägen vara gynnsam eftersom den inte kräver att DNA:s fosfodiesterbindningar bryts, vilket sker vid TDG-initierad basexcisionsreparation. Hittills har dock ingen enzymatisk aktivitet för dekarboxyleringssteget identifierats, även om dekarboxylering verkar förekomma .

Många vävnader ackumulerar ganska stora mängder 5hmC, mycket större än vad som skulle kunna förväntas om denna bas bara var en tillfällig mellanprodukt i en sekventiell oxidationsväg som leder till demetylering av DNA. Därför kan 5hmC vara en epigenetisk modul som har sina egna unika biokemiska kodningsegenskaper. Denna funktion kan vara negativ eller avstötande, eftersom oxidationen av metylgruppen under produktionen av 5hmC blockerar bindningen av proteiner som annars skulle interagera med 5hmC . Alternativt kan funktionen vara positiv eller instruerande om det finns proteiner som specifikt binder till 5hmC. Hittills har flera olika proteiner visat förmåga att känna igen 5hmC, åtminstone in vitro, däribland UHRF1 , MBD3 , MeCP2 och flera andra som identifierats genom en proteomisk metod . Den biologiska betydelsen av deras bindning till 5hmC är dock fortfarande inte helt klarlagd. De flesta av dessa proteiner har också andra funktioner och är därför kanske inte unikt utformade för att interagera med 5hmC.

Rollen för 5-hydroximetylcytosin i däggdjurs utveckling och differentiering

Den funktionella rollen för 5hmC i däggdjurs genomer är fortfarande oklar. I början av däggdjurens livscykel, vid befruktning av oocyter med spermier, oxideras större delen av 5mC i faderns (spermiernas) genom till 5hmC . Detta oxidationssteg, som tidigare ansågs återspegla verklig DNA-”demetylering”, är specifikt för det faderliga genomet, medan det moderliga (oocytära) genomet förblir skyddat från Tet-katalytisk oxidation. Oxidationen av det faderliga genomet katalyseras av Tet3, som kodas av den enda Tet-gen som uttrycks i betydande omfattning i oocyter och zygoter . Genetisk knockout av Tet3 hos möss resulterar i misslyckad oxidation av det faderliga genomet, försämrad utveckling och perinatal dödlighet .

En annan viktig utvecklingsövergång inbegriper global DNA-demetylering i primordiala könsceller (PGC) som påbörjas omkring embryodag 8,5-9,5 och avslutas nära embryodag 13,5. Mekanismerna för metyleringsutplåning i PGC har förblivit i stort sett oklara och kontroversiella. Det har länge antagits att replikationsoberoende aktiv DNA-demetylering är en nyckelväg som sannolikt är involverad i detta steg . Nyare uppgifter talar dock för en passiv förlust av metylering som orsakas av bristande metyleringsunderhåll under DNA-replikation . Denna passiva förlust av 5mC kan effektivt inledas genom omvandling av 5mC till 5hmC . Tet1 och Tet2 är de 5mC-oxidaser som uttrycks mest i PGC i detta skede . Avkommor från möss som saknar Tet1 och Tet2 har brister i DNA-demetylering vid präglade gener . Tet1/2-bristande djur av båda könen var dock fertila, men honorna hade mindre äggstockar och minskad fertilitet. Deletion av Tet1 och Tet2 kan ge livskraftiga vuxna, även om majoriteten av dessa möss dör under embryogenesen eller runt födseln och uppvisar olika utvecklingsdefekter . Uppgifterna tyder på att Tet1/2-inducerad 5mC-oxidation i PGC inte är absolut nödvändig för att producera livskraftig avkomma. Den för närvarande tillgängliga informationen om DNA-demetylering i zygoter och i PGCs saknar fortfarande en mer specifik analys av 5hmC på DNA-sekvensnivå, vilket till exempel kan åstadkommas genom TAB-sekvensering . Det förväntas att sådan information kommer att klargöra den globala eller lokusspecifika inblandningen av 5hmC-bildning i initieringen av passiv (eller aktiv) DNA-demetylering. Den tidigare inblandningen av basexcisionsreparationsprocesser i omprogrammering av könslinjer, som i sig skulle utgöra en enorm risk för upprätthållandet av genomets integritet om den var verksam på global nivå, kan ha olika andra förklaringar. I ett scenario kan förekomsten av basexcisionsreparation förklaras av kravet på att motverka falska, icke-målinriktade oxidationsreaktioner som katalyseras av Tet-oxidasaktivitet på guaniner vid metylerade CpG-platser (guanin är den DNA-bas som är mest mottaglig för oxidation). I en annan miljö kan 5hmC oxideras ytterligare, kanske vid specifika sekvenser, av Tet-proteiner för att bilda 5caC, som sedan avlägsnas genom basexcisionsreparation som initieras av TDG .

Eftersom 5hmC är vanligast i hjärnvävnad har det blivit en prioritering att förstå funktionen av denna modifierade bas i hjärnan. I DNA från mänsklig hjärnbark är till exempel nivån av 5hmC cirka 1 % av alla cytosiner eller 20-25 % av alla 5mC-baser . Detta motsvarar ungefär 6 000 000 5hmC-baser per haploid arvsmassa. Dessa nivåer tyder helt klart på att 5hmC har en viktig funktionell roll i däggdjurshjärnan. Studier som hittills rapporterats har visat att 5hmC i hjärnvävnader är mycket rikligt förekommande inom genregioner, antingen vid promotorer eller i ännu högre grad inom intrageniska regioner, de så kallade genkropparna . Det är tänkbart att bildandet av 5hmC vid promotorer, CpG-öar eller CpG-öarnas stränder (kanter) fungerar analogt med en reparationsprocess för att oxidera och så småningom avlägsna olämpligt införda 5hmC:er i dessa regioner . 5hmC-avlagring i promotorer eller genkroppar korrelerar ofta positivt med genaktivitet. Mekanismen för hur genkroppsassocierad 5hmC ökar transkriptnivåerna är för närvarande okänd. En möjlighet är att 5mC-oxidation frigör en repressiv effekt på transkriptionen, kanske genom att motverka falska intrageniska anti-sense-transkriptioner. Andra förklaringar kan innefatta det faktum att 5hmC har en destabiliserande effekt på DNA-strukturen som potentiellt gynnar transkriptionsapparatens öppnande av dubbelhelixen.

5hmC, även om det inte känns igen av flera metyl-CpG-bindande proteiner, inklusive MBD1, MBD2 och MBD4 , kan binda MeCP2 , ett metyl-CpG-bindande protein som är rikligt förekommande i hjärnan och som är muterat i den neurologiska sjukdomen Retts syndrom . Tidigare studier, där man använde MeCP2:s metyl-CpG-bindningsdomän (MBD) i stället för det fullständiga proteinet, visade inte att MeCP2 binder till 5hmC . Orsakerna till dessa skillnader är oklara. Kopplingen mellan MeCP2 och 5hmC i hjärnan är av särskilt intresse eftersom nivåerna av 5hmC är högst i hjärnan och MeCP2 är ett rikligt förekommande protein i hjärnan och når nivåer som liknar histon H1:s nivåer. Av dessa skäl kan man förvänta sig en genomomfattande snarare än sekvensspecifik mekanistisk roll för 5hmC-bindning av MeCP2 i hjärnan.

Som nyligen visats är bildandet av 5hmC kritiskt för hjärnans utveckling. Basen är riklig i utvecklande neuroner där dess nivå ökar i förhållande till neurala progenitorceller och där den specifikt lokaliseras till genkroppar av gener som är viktiga för neuronal differentiering . Tet3 uttrycks mest i den växande hjärnbarken hos musen, följt av Tet2, och nivåerna av Tet1 är mycket låga i denna vävnad. En ökning av nivåerna av Tet2, Tet3 och 5hmC i differentierande neuroner sammanfaller med en minskning av Polycombs H3K27-metyltransferas Ezh2 och förlust av H3K27me3 vid kritiska gener. En minskning av nivåerna av Tet2 och Tet3 eller en ökning av Ezh2-uttrycket resulterar i ofullständig eller blockerad neurondifferentiering . Således främjar bildandet av 5hmC neurondifferentiering genom att modulera uttrycket av de gener som är mest kritiska i denna viktiga utvecklingsövergång.

Förlust av 5-hydroximetylcytosin i cancer

Nivåerna av 5hmC i cancer är starkt reducerade i förhållande till motsvarande normal vävnad som omger tumören . Med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri, anti-5hmC-antikroppsbaserade immuno-dot blots och immunohistokemi visade vi tumörassocierad förlust av 5hmC för cancer i lungan, hjärnan, bröstet, levern, njurarna, prostatan, tarmen, livmodern och melanom . Andra forskare bekräftade denna observation genom att visa förlust av 5hmC i olika typer av solida tumörer . Dessutom har återinförande av TET2 visat sig återställa 5hmC-nivåerna och minska den metastatiska potentialen hos melanomceller . När vi samimmunfärgade vävnadssektioner med antikroppar mot 5hmC och mot Ki67-antigenet, som är en markör som endast finns i prolifererande celler, observerade vi att 5hmC och Ki67 nästan aldrig förekommer samtidigt i en enda cell . På en klinisk diagnostisk nivå skulle en kombinerad immunohistokemisk analys av 5hmC-förlust och förekomst av Ki67-positiva celler kunna utvecklas till en biomarkör för cancerdiagnostik. Avsaknaden eller den kraftiga minskningen av 5hmC i tumörer tyder på att prolifererande celler förlorar 5hmC. I de flesta fall är den största delen av tumörmassan utarmad på 5hmC även när Ki67-positiva celler är sällsynta, vilket tyder på att dessa tumörceller har haft en tidigare historia av proliferation som lett till förlust av 5hmC, som sedan inte återupprättats . Den replikationsberoende förlusten av 5hmC återspeglar en situation som påminner om den i preimplantatembryon där den initiala bildningen av 5hmC i faderns DNA följs av replikationsberoende förlust eller utspädning av detta märke . På samma sätt minskar det globala 5hmC-innehållet snabbt när celler från normal vävnad anpassar sig till cellodling . Den enklaste förklaringen är att oxidation av 5mC ger upphov till en hemihydroxymetylerad CpG-plats i DNA som inte känns igen av DNMT1 under DNA-replikationen. En sådan förklaring stämmer överens med in vitro-studier som visar att DNMT1 inte kan verka på CpG-platser som innehåller 5hmC . Andra förklaringar till minskningen av 5hmC i cancer är dock också möjliga. Nivåerna av TET-proteiner kan vara lägre i tumörvävnad än i dess motsvarande motsvarighet i normal vävnad. Även om vi inte observerade några konsekventa skillnader på RNA-nivå för TET1, TET2 eller TET3 i lung- och hjärntumörer i förhållande till normal vävnad , har andra rapporterat lägre nivåer av TET-genuttryck i cancer . En ytterligare möjlighet är att cancerceller innehåller komprometterade metaboliska vägar som är involverade i produktionen av co-faktorn för TET-aktivitet, 2-oxoglutarat (se nedan).

Mutation av TET2 i mänsklig cancer

TET1 tillhör en familj av proteiner som kännetecknas av att de främjar omvandlingen av 5mC till 5hmC i däggdjurs-DNA . Det finns tre identifierade familjemedlemmar som tillhör TET-familjen: TET1, TET2 och TET3. TET1 finns på människans kromosom 10q21.3, medan TET2 finns på kromosom 4q24 och TET3 på kromosom 2p13.1. TET1-enzymet består av en DNA-bindningsdomän med zinkfinger CXXC, en cysteinrik region och en 2-oxoglutarat- och järn(II)-beroende dioxygenas-domän (2OGFeDO). TET3 innehåller också en N-terminal CXXC-domän . TET2-genen genomgick dock en kromosomal geninversion under evolutionen, vilket separerade dess CXXC-domän från den katalytiska domänen och skapade en ny CXXC-domängen vid namn IDAX/CXXC4, som kodar för en negativ regulator av TET2 . Baserat på EST-profiler och expression arrays visar TET1 störst uttryck under embryogenesen och visar inget relevant uttryck i vuxna vävnader. TET2 uttrycks främst i hematopoietiska celler och TET3 verkar ubiquitärt uttryckt i vuxna mänskliga vävnader.

Leukemi är en sjukdom där, under normal hematopoietisk stamcellsdifferentiering, den klonala expansionen av hematopoietiska prekursorceller i benmärgen påverkas i ett visst differentieringsstadium, vilket orsakar en obalans mellan differentiering och självförnyelse. Olämplig expansion av hematopoietiska progenitorceller orsakas främst av en blockering av cellmognad. Myelodysplastiskt syndrom (MDS) störningar i hematopoesen kännetecknas av cytopeni (lågt antal blodkroppar), ineffektiv hematopoesi i en eller annan cellinje och en ökad risk för omvandling till akut myeloisk leukemi (AML) . Vid AML leder den snabba tillväxten av onormala vita blodkroppar i benmärgen till en blockering av produktionen av olika celler från andra cellinjer.

TET2 har hittats muterad hos patienter med myeloproliferativa neoplasmer (MPN), MDS, AML och kronisk myelomonocytär leukemi (CMML), och är den vanligaste muterade genen i MDS . Mutationer av TET1 eller TET3 observeras inte i MDS och TET2-mutationen korrelerar inte heller med flera andra kända vanliga mutationer . Intressant nog hittas isocitratdehydrogenas 1/2 (IDH1/2)-mutationer sällan tillsammans med TET2-mutationer, men de har liknande effekter som TET2-mutationer på hematopoetiska stamceller (HSC) . Medan TET2-mutationer är förknippade med minskad total överlevnad vid AML jämfört med patienter med TET2 av vildtyp, främjar TET2-mutationer hos MDS- och MPN-patienter progression till AML . TET2-genen består av totalt elva exoner som översätts till en proteinprodukt med 2002 aminosyror . TET2-mutationer i myeloisk cancer har oftast observerats inom exon 3a och 10, som är de längsta exonerna . Både multipotenta och engagerade progenitorceller i den hematopoetiska linjen är måltavlor för TET2-mutationer i MPN, vilket innebär att TET2 spelar en viktig roll i myelopoesen . Deletioner av TET2 och förlust av heterozygositet eller uni-parental disomi observerades hos (9 %) MDS/AML-patienter med muterad TET2, där det är troligt att vildtypsallelen går förlorad under rekombination, vilket gör att den muterade TET2 kan främja en fenotyp med förlust av funktion. Kosmider et al. observerade att 50 % av patienterna med muterad TET2 hade genetiska defekter som riktade sig mot de två TET2-kopiorna. Mutationer i TET2 verkar leda till funktionsförlust, vilket tyder på att den kan spela en tumörsupprimerande roll.

Förståelse av de underliggande konsekvenserna av att muterad TET2 saknar funktion och dess roll i myeloida maligniteter är en aktuell forskningsprioritet. Flera laboratorier genererade villkorliga Tet2 knockout-musmodeller där kritiska Tet2-exoner var riktade. Moran-Crusio et al. observerade att Tet 2-/- möss utvecklade splenomegali vid 20 veckors ålder och uppvisade fenotyper som liknade dem som observerades hos mänskliga CMML-patienter med mutant TET2. Data från de olika musmodellerna ledde till liknande observationer. Att radera Tet2 är inte embryonalt dödligt. En viktig observation som gjordes av Moran-Crusio et al. och Ko et al. är att hematopoetiska stamceller från Tet2-/- möss har en ökad förmåga att repopulera det hematopoetiska kompartmentet in vivo under kompetitiva rekonstitutionsanalyser med konkurrens från HSC från Tet2+/+ celler. Analyser av olika organ från Tet2-/- möss visade att förlusten av Tet2 inte kompenseras av en ökning av Tet1- eller Tet3-uttrycket . 5hmC-nivåerna är signifikant minskade i benmärg och mjälte hos Tet2-/- möss . Tet2-/- möss uppvisar en ökning av HSC:er med en liten ökning av myeloida progenitorer, vilket gör att hematopoiesen är snedfördelad mot monocyter/makrofager. Det föreslås att ett aktivt Tet2 skulle reglera normal hematopoesi för att säkerställa en korrekt fördelning av linjerna och kontrollerad differentiering av HSC:er. Av särskilt intresse är effekten av TET2-mutationer på nivåerna och mönstren av 5mC i genomet. De nuvarande uppgifterna är dock långt ifrån entydiga. Medan en rapport visade att TET2-mutationer i AML är förknippade med en DNA-hypermetyleringsfenotyp, tyder andra uppgifter på att benmärgsprover från patienter med TET2-mutationer har låga 5hmC-nivåer och DNA-hypometylering . Situationen kompliceras av det faktum att hematopoetiska maligniteter ofta kännetecknas av mutationer i flera epigenetiska modifierare, inklusive EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A och ASXL1, vilket potentiellt kan dölja alla direkta samband . I en studie hade till exempel åtta av elva patienter med DNMT3A-mutationer (73 %) i T-cellslymfom också TET2-mutationer .

Mutationer i co-faktorvägar

5mC-oxidaser är 2-oxoglutaratberoende enzymer (figur 2). Denna kofaktor produceras i tricarboxylsyracykeln från isocitrat av enzymet IDH. Intressant nog innehåller flera typer av mänskliga tumörer mutationer i IDH1-genen. IDH1-mutationer är särskilt vanliga i gliom av grad II och III, där de förekommer hos upp till 70 % av patienterna . Mutationer i IDH1 och IDH2 förekommer också i myeloisk leukemi och några andra maligniteter, men i lägre frekvens . Dessa IDH1-mutationer är inte spridda över hela genen utan återfinns nästan uteslutande vid aminosyraposition 132. Detta fynd tyder på att detta särskilda IDH1-muterade protein har en funktionell förstärkningsegenskap. En överraskande upptäckt var att IDH1-kodon 132-mutanten från arginin till histidin producerar onkometaboliten 2-hydroxyglutarat (2HG) som reaktionsprodukt i stället för 2-oxoglutarat . Det verkar som om den isocitratoxidationsreaktion som utförs av denna mutant är ofullständig och endast producerar 2HG. Dessutom är 2HG en kompetitiv hämmare av många, om inte alla, 2-oxoglutaratberoende enzymatiska aktiviteter. TET-proteinerna utgör en klass av sådana enzymer, och det visades att 2HG är en hämmare av TET1 och TET2 .

En intressant korrelation till att ha muterat IDH1 i gliomtumörer är att IDH1-muterade tumörer nästan alltid är förknippade med rikliga förändringar av DNA-metylering i hela arvsmassan, vilket indikeras av en utbredd hypermetylering av CpG-öar . Denna fenotyp har kallats CpG-island methylator fenotyp (eller CIMP) . Det är frestande att anta att CIMP i IDH1-muterade gliom är kopplat till en misslyckad 5hmC-produktion i dessa tumörer eftersom TET-aktiviteten äventyras av 2HG. I själva verket ledde experimentell introduktion av en IDH1-muterad konstruktion i humana astrocyter till uppkomsten av en CIMP-liknande fenotyp . Dessutom observerades DNA-hypermetylering i villkorliga knock-in-möss där den vanligaste Idh1-mutanten R132H sattes in i det endogena Idh1-lokuset och uttrycktes i hematopoetiska celler . Vid en direkt jämförelse av 5hmC-nivåerna i DNA mellan IDH1-muterade gliom och gliom av IDH1-wildtyp observerade vi dock inga väsentliga skillnader mellan dessa två kategorier av hjärntumörer . Därför måste man komma ihåg att mutant IDH1 och dess metabolitprodukt 2HG inte bara påverkar TET-enzymer utan också hämmar många lysin-demetylaser som är beroende av 2-oxoglutarat och andra 2-oxoglutaratberoende enzymer. Dysfunktionen hos dessa lysin-demetylaser kan ha en sekundär inverkan på DNA-metyleringsmönster vid CpG-öar.