Acetylkolin syntetiseras från acetylkoenzym A och kolin av enzymet kolinacetyltransferas. I nervsystemet tros detta enzym främst finnas i nervterminalernas cytoplasma. Coenzym A syntetiseras i mitokondrier och får tillgång till kolinacetyltransferas efter transport genom mitokondriernas membran till cytoplasman. Förutom att det syntetiseras i levern kommer det kolin som används i acetylkolinproduktionen från kosten. Det finns ett transportsystem i kapillära endotelceller som ansvarar för transporten av kolin, i dess fria och fosfolipidform, till hjärnan. Hydrolys av kolinhaltiga fosfolipider kan också frigöra kolin som används i acetylkolinsyntesen. Eftersom kolinacetyltransferas inte är mättat av de koncentrationer av acetylkoenzym A och kolin som beräknas finnas i nervterminalen, verkar det som om acetylkolinsyntesen är beroende av tillgången på prekursorer. Enzymaktiviteten regleras också av produkthämning; genom att binda till en allosterisk plats på kolinacetyltransferas hämmar acetylkolin dess aktivitet. Dessutom påverkar massverkan och neuronal aktivitet hastigheten på acetylkolinbildningen. Kortsiktig reglering av enzymaktiviteten sker delvis genom fosforylering som induceras av proteinkinaser. Det finns inga mycket specifika och potenta hämmare av enzymet och det bör noteras att farmakologisk blockering av detta steg (t.ex. med naftylvinylpyridin) i acetylkolins livscykel ger en mindre djupgående effekt på transmittorn än vad hämning av kolintransporten gör.
En specifik acetylkolintransportör med låg affinitet ansvarar för upptag av transmittorn från cytoplasman till vesiklar. Generna för kolinacetyltransferas och den vesikulära acetylkolintransportören är organiserade i ett enda genlocus, och transkriptionen av de två generna är vanligtvis samreglerad. (±)-vesamicol är en selektiv hämmare av denna transportör, där L-(-)-vesamicol är mer potent än D-(+)-vesamicol. När acetylkolin väl är förpackat i vesiklar kan det frigöras genom stimulusinducerad exocytos. Flera kraftfulla toxiner påverkar frisättningen av acetylkolin, särskilt botulinumtoxin som hämmar frisättningen.
Neuronalt acetylkolinesteras inaktiverar mycket snabbt majoriteten av det acetylkolin som frisätts i hjärnan, även om butyrylkolinesteras som finns i gliaceller kan hydrolysa en liten del av acetylkolinet i synapsen. I periferin finns acetylkolinesteras i muskler som får kolinerg innervation, medan butyrylkolinesteras är mer utbrett. Det finns ett antal reversibla (t.ex. physostigmin, BW284C51) och irreversibla (t.ex. iso-OMPA) hämmare av acetylkolinesteras, och dessa läkemedel har som effekt att de förlänger de synaptiska effekterna av acetylkolin. Andra generationens reversibla antikolinesteraser som donepezil, rivastigmin (ENA 713), eptastigmin och galantamin (galanthamin) används som behandling av Alzheimers sjukdom. Vissa andra generationens kolinesteraser har dragits tillbaka från klinisk användning på grund av oacceptabla biverkningar (t.ex. takrin, metrifonat). Irreversibla acetylkolinesterashämmare används som insekticider och kemiska stridsmedel. Kolin, som frigörs från acetylkolin med hjälp av acetylkolinesteras, tas upp igen i kolinerga terminaler med hjälp av en transportör med hög affinitet och återanvänds i transmittorsyntesen. Hemicholinium-3 hämmar kolintransporten kraftigt och reversibelt, vilket leder till en kraftig minskning av acetylkolinbildningen. Till skillnad från hemicholinium-3 är A-4 (en bis 4-metylpiperidinanalog av HC-3) aktiv efter perifer administrering. Kvävesenapsanaloger av kolin är potenta irreversibla hämmare av upptag av kolin med hög affinitet.