Användning av polyeteniminpolymer i cellkultur som fästfaktor och lipoinfektionsförstärkare

PEI främjar fästningen av svagt förankrade celler och primära vävnader

PC-12-celler används som en modell för neuronal differentiering i laboratoriet, eftersom behandling av dessa celler med nervtillväxtfaktor (NGF) inducerar neuritförlängning och uttryck av biokemiska markörer för den sympatiska neuronala fenotypen . De växer som svagt förankrade celler och kollagen- eller polylysinpolymerer används ofta för förbeläggning av plattor för PC-12-cellodling . PC-12-celler odlades i laboratoriet i naiva brunnar eller i brunnar som var förbelagda med olika fästfaktorer (multiwell-12 vävnadskulturskålar), för att observera effekten på cellernas förankring i substratet. I avsaknad av beläggningsmedel uppvisade cellerna en karakteristisk tendens att bilda kluster av celler som ackumuleras mot centrum av brunnen; dessa celler är fast fästade sinsemellan, men mycket svagt fästade vid vävnadskulturskålen (figur 1D). Detta resulterar i en mycket heterogen fördelning av cellerna (mycket få celler finns kvar i kanten av brunnarna) och en betydande förlust av celler vid tvättning eller byte av medium. Förbehandling av plattorna med PEI resulterade i en betydligt mer homogen fördelning av cellerna i brunnen, där cellerna fäster stadigt vid plattan och visar en mycket lägre tendens till klusterbildning (figur 1A). Som jämförelse förbehandlades plattorna också med andra vanligt förekommande beläggningsmedel, kollagen (figur 1B) och poly-D-Lysin (PDL; figur 1C; figur 1C), vilket också resulterade i fastare fastsättning av cellerna på plattorna och en mer homogen fördelning av cellerna.

För att ytterligare testa den förankringsförstärkande egenskapen som observerades med PEI-förbehandling av odlingsskålarna, användes ett andra system. Retinala explanter från teleostfiskar har använts för att studera nervregeneration . När fiskens optiska nerv utsätts för en skada inleds en regenerationsreaktion och näthinnans ganglieceller (RGC) förlänger sin axon mot den tectala målvävnaden. Om näthinnan från en sådan ”förberedd” fisk avlägsnas och odlas, observeras regenereringsreaktionen in vitro genom en påskyndad förlängning av långa neuriter. Detta fenomen kräver dock användning av extracellulär matris eller fästfaktorer (t.ex. kollagen eller PDL-beläggning), eftersom explantationsplantorna visar mycket låg affinitet för den obelagda plastytan. Experiment genomfördes för att undersöka om PEI kan fungera som en fästfaktor som främjar axonala utväxter från zebrafiskens näthinneexplantat. Retinaexplantat från kontrollzebrafiskögon kunde fästa på PEI-förbehandlade odlingsskålar (figur 1E). Dessutom kunde näthinneexplantat från fiskar som fått en konditioneringsskada sträcka ut axoner kraftigt när de odlades med PEI som fästfaktor (figur 1F).

Resultaten med näthinneexplantaten tyder på att neuronala celler som fästs på PEI-belagda tallrikar kan differentiera och generera neuriter som fäster väl vid substratet. För att testa denna hypotes med de pro-neuronala PC-12-cellerna utfördes differentieringsexperiment genom NGF-behandling med celler som fästes på tallrikar belagda med PEI. De PC-12-celler som behandlades med NGF förblev stadigt fästa vid plattan under flera dagar och genererade nätverk av neuriter (figur 2). Resultaten tyder på att PEI är tillåtande för differentieringsprocessen och för att neuriterna ska fästa på tallriken. De differentierade cellerna förblev fast förankrade under alla immunocytokemiska experiment (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García och R. P. Ballestero, opublicerade resultat).

Styrka av förankring av eukaryota celler på odlingsskålar som förbehandlats med PEI och andra fästfaktorer

Tre olika cellinjer valdes ut för att testa PEI:s förmåga att främja en stark förankring på odlingsskålar av plast. PC-12- och HEK-293-celler har ovan beskrivits som svagt förankrade. Å andra sidan är MYS-celler primära fibroblaster som fäster starkt vid plastodlingsskålar och växer för att bilda ett monolager av celler på ytan. För att testa de olika cellernas starka förankring i plattorna utfördes ett protokoll där fyra på varandra följande tvättar med isotonisk buffert utfördes, följt av ett kolorimetriskt protokoll för att räkna de celler som stannade kvar i plattan (baserat på det vitala färgämnet neutralt rött). Plattor som förbehandlats med de olika fästfaktorerna jämfördes med plattor som inte fick någon förbehandling (obehandlade). Experimenten utfördes i tre exemplar, och medelvärdet av det färgämne som behölls i de plattor som fick varje behandling beräknades. Dessa medelvärden normaliserades till det medelvärde som erhölls med PEI-förbehandling, som tilldelades det godtyckliga värdet 100,0 % i alla experiment. Resultaten från representativa experiment med de tre cellinjerna visas i figur 3 (minst tre oberoende experiment utfördes med varje cellinje). PC-12-cellerna fäste nästan lika bra på plattor belagda med PEI, kollagen eller PDL (relativt antal celler på 100,0 % ± 5,3 %, 89,3 % ± 5,0 % och 96,3 % ± 5,8 % för PEI, kollagen respektive PDL). En betydande förlust av celler observerades dock när man jämförde obehandlade plattor med PEI-förbehandlade plattor, med ett relativt antal celler på 43,9 % ± 5,8 % (figur 3A). När det gäller HEK-293 fäste cellerna starkt vid både PEI- och PDL-preparerade brunnar. I det representativa experimentet som visas i figur 3B var det relativa antalet med dessa två behandlingar 100,0 % ± 0,4 % respektive 96,8 % ± 1,7 %. Ett stort antal celler förlorades dock när de pläterades i de obehandlade brunnarna (relativt antal 8,3 % ± 0,6 %) eller i de brunnar som förbehandlats med kollagen (11,5 % ± 1,2 %), vilket tyder på att dessa celler fäster ganska löst vid plast- eller kollagenbelagda brunnar. Slutligen, när fibroblastcellerna (MYS-cellerna) användes, verkade cellerna fästa ganska bra på alla fyra ytorna, även på de obehandlade brunnarna (figur 3C). Figur 3C visar en representativ plott med ett relativt antal MYS-celler på 100,0 % ± 2,2 %, 85,9 % ± 7,8 %, 73,7 % ± 6,6 % och 77,1 % ± 1,4 %, med brunnar som förbehandlats med PEI, kollagen eller PDL, respektive obehandlade brunnar. Denna cellinje fäster därför ganska väl vid den obehandlade plastytan i jämförelse med PC-12- och HEK-293-cellinjerna.

För att ge en indikation på variationen mellan experimenten beräknades medelvärden ± standardavvikelser för de relativa cellräkningar som erhållits i de oberoende experimenten för varje cellinje och behandling (observera att eftersom räkningen för PEI-preparerade brunnar i alla experiment sattes till 100,0 % är värdet för det globala genomsnittet med detta beläggningsmedel exakt 100,0 % för alla cellinjer). De jämförande resultaten för de andra behandlingarna anges nedan. För PC-12-cellerna var det relativa antalet 81,5 % ± 8,8 % för kollagenförbehandlade brunnar (n = 4), 93,9 % ± 21,2 % för PDL-förbehandlade brunnar (n = 4) och 52,1 % ± 13,7 % för obehandlade brunnar (n = 4). För HEK-293-cellerna var det relativa antalet 16,3 % ± 12,7 % för kollagenförbehandlade brunnar (n = 3), 99,6 % ± 2,5 % för PDL-förbehandlade brunnar (n = 3) och 9,0 % ± 4,1 % för obehandlade brunnar (n = 3). I experimenten med MYS-celler var genomsnittet av de relativa räkningarna med kollagenpreparerade brunnar 92,7 % ± 16,2 % (n = 3), 71,1 % ± 6,7 % för PDL-preparerade brunnar (n = 3) och 78,4 % ± 11,5 % för obehandlade brunnar (n = 3). Statistisk analys visar att förbättringen av vidhäftningen av både PC-12- och HEK-293-celler till PEI-preparerade skålar jämfört med obehandlad plast är signifikant (p < 0,05 respektive p < 0,01, t-testanalys), medan den inte är statistiskt signifikant för MYS-celler (p > 0,05).

För att ytterligare karakterisera egenskaperna hos PEI som fästfaktor för svagt förankrade celler utfördes experiment för att analysera den dosering av PEI som kan ge optimal cellförankring, det intervall av cellantal som kan dra nytta av närvaron av PEI och stabiliteten hos PEI som fästfaktor. Figur 4A visar resultaten från ett representativt experiment där man testar HEK-293-cellernas fäststyrka på tallrikar som är belagda med olika doser PEI. Cellantalet normaliserades till det värde som erhölls för behandlingen med 25 μg/ml PEI, vilket sattes till 100,0 %. Resultaten visar att koncentrationer av PEI på 2,5 μg/ml eller högre resulterade i maximal fästningsförbättring, vilket tyder på att plastskålens yta är helt belagd med polymeren vid dessa koncentrationer. De högre koncentrationerna av polymeren verkade inte ha några toxiska effekter på cellerna om det överskott av PEI som återstod i lösningen avlägsnades noggrant (lätta toxiska effekter observerades vid koncentrationen 250 μg/ml om lösningen inte avlägsnades helt efter behandlingen). Försöket som visas är representativt för fyra oberoende försök. Figur 4B visar de resultat som erhållits med olika antal PC-12- och HEK-293-celler. Figuren visar relativa celltal, där ett godtyckligt värde på 100,0 % tilldelades det genomsnittliga antalet som erhölls från de PEI-behandlade brunnarna med det högsta antalet av varje cellinje (3,2 × 105 HEK-293-celler och 1,5 × 106 PC-12-celler). Resultaten visar att PEI fungerade väl som en fästfaktor över ett brett spektrum av cellantal för både PC-12- och HEK-293-celler. Lägre cellantal kunde inte testas på ett tillförlitligt sätt eftersom de låg nära känslighetsgränsen för neutralrödanalysen. De resultat som visas är representativa för minst fyra oberoende experiment som utförts med varje cellinje. Figur 4C visar resultaten av ett experiment som utfördes för att testa stabiliteten hos PEI som fästfaktor. I detta experiment behandlades en uppsättning plattor med PEI och förvarades sedan i PBS vid 4 °C i 10 dagar. I ett andra test behandlades plattorna med PEI och förvarades (med medium) i CO2-inkuberingsskåp vid 37 °C i 3 dagar, med ett mediumbyte var 24:e timme. PEI:s prestanda i dessa plattor jämfördes sedan med plattor som behandlats med PEI med hjälp av det standardprotokoll som beskrivits för tidigare experiment. Resultaten visar det relativa antalet celler normaliserat till genomsnittet av de absorbanser som erhållits med de PEI-behandlade standardplattorna, vilket fick det godtyckliga värdet 100,0 %. Resultaten visar att PEI-beläggningen förblir stabil på plastskålens yta under minst 10 dagars kylning och att den inte avlägsnas genom inkubation vid 37 °C i medium eller till och med genom upprepade mediumbyten. Resultaten är representativa för 4 oberoende experiment som utförts i tre exemplar.

PEI-förbehandling förbättrar lipoinfektion av svagt förankrade celler

Transfektion av eukaryota celler genom lipoinfektion innebär flera steg, medietillsatser och byten, vilket kan ta ut sin rätt i svagt förankrade celler. Även om man försöker undvika cellförluster kan de svagt förankrade cellerna vara mindre effektiva när det gäller att ta upp transfektionskomplexen. Eftersom PEI-förbehandling av cellodlingsskålar ökade cellernas fäststyrka på sådana ytor, var hypotesen att fästfaktorn kan ha en positiv effekt på det transfektionsutbyte som erhålls genom lipoinfektion. De tre ovan beskrivna cellinjerna användes för att testa denna hypotes med hjälp av de ytbehandlingsmedel som tidigare undersökts. Transfektioner utfördes med en plasmid som kodar för reporterenzymet β-galaktosidas. Transfektionsresultatet övervakades genom bestämning av reporterenzymaktiviteten i lysat från de transfekterade cellerna. Minst två oberoende analyser i tre exemplar utfördes med varje cellinje. Representativa diagram visas i figur 5. Avkastningen (β-galaktosidasaktivitet) normaliserades till den aktivitet som erhölls med PEI-förbeläggning, som sattes som referens till 100,0 %. Generellt observerades att transfektionsutbytet förbättrades i de svagt förankrade cellerna genom förbeläggning med medel som främjar cellernas fastsättning på plattan. När det gäller PC-12-celler resulterade förbeläggning av brunnarna med PEI, kollagen eller PDL i en 2- till 3-faldig ökning av transfektionsutbytet jämfört med obehandlade brunnar: relativa utbyten på 100,0 % ± 1,4 % för PEI, 87,0 % ± 8,7 % för kollagen och 100,1 % ± 2,4 % för PDL, jämfört med 42,9 % ± 2,2 % för de obehandlade brunnarna (figur 5A). Förbättringen av transfektionsutbytet genom PEI-förbehandling var mer uttalad för HEK-293-celler. Experimentet i figur 5B visar en relativ aktivitet på 21,1 % ± 3,4 % för cellerna i de obehandlade brunnarna, jämfört med 100,0 % ± 8,4 % för de PEI-förbehandlade brunnarna (ungefär 5-faldig ökning). Förbehandling med kollagen eller PDL resulterade i mer blygsamma induktioner (ungefär 2- till 3-faldigt i figur 5B). Den lägsta förbättringen observerades med kollagen, i likhet med den lägre förstärkning av fastsättning av HEK-293-celler som tidigare observerades i figur 3B. Slutligen, för de starkt fästande MYS-fibroblasterna observerades ingen signifikant positiv effekt av att använda fästfaktorer i transfektionsproceduren. Variationerna var vanligtvis mindre än 20 % för alla experimentella förhållanden. Det representativa experimentet som visas i figur 5C visar faktiskt ett något högre transfektionsutbyte för de obehandlade brunnarna än för de PEI-förbehandlade plattorna (relativ aktivitet på 117,7 % ± 3,2 % för de obehandlade brunnarna jämfört med 100,0 % ± 4.8 % för de PEI-preparerade brunnarna, eller ungefär 1,2 gånger högre transfektionsutbyte i kontrollen).

Vid sammanställning av resultaten från alla utförda experiment var den genomsnittliga viktsökning (± standardavvikelse) som observerades i transfektionsutbytet av PC-12-celler förankrade på PEI jämfört med celler på obehandlade brunnar 2.4-faldigt (± 0,1-faldigt; n = 3), medan ökningen med HEK-293-celler var 6,3-faldigt (± 0,5-faldigt; n = 2). t-test statistisk analys visar att båda ökningarna är signifikanta (p < 0,05). Ingen signifikant transfektionsförbättring observerades i försöken med MYS-celler, med en genomsnittlig vikningsförändring på 1,0-faldig (± 0,3-faldig; n = 2) genom förbehandling med PEI (i princip identisk med utbytet utan behandling).