Ansamlingsprinciper från in vitro-studier
Funktionella bakteriella 30S- och 50S-ribosomala subenheter kan återskapas in vitro från rRNA plus vart och ett av de ribosomala proteinerna. Detaljerade studier av de biokemiska och biofysiska principer som ligger till grund för ribosomernas sammansättning in vitro har gett användbara paradigm för att vägleda undersökningar av ribosomernas biogenes in vivo.
En av de första principer som avslöjats genom dessa experiment är att sammansättningen av r-proteiner till ribosomala underenheter sker på ett hierarkiskt sätt. Rekonstruktionsstudier av bakteriella 30S ribosomala subenheter definierade en ”monteringskarta” för den ordning i vilken varje r-protein associeras med rRNA. Baserat på deras ordning i bindningshierarkin betecknas r-proteiner som primära (binder direkt till rRNA), sekundära (bindningen är beroende av primära bindningsproteiner) eller tertiära proteiner (bindningen är beroende av sekundära bindningsproteiner). Även om en sådan beroendekarta har visat sig vara en mycket användbar utgångspunkt ger den ingen information om proteinbindningens kinetik. Snarare kan sammansättningsvägen till stor del återspegla den ordning i vilken varje r-protein är mest stabilt associerat med rRNA. Dessutom tar kartan över sammansättningen inte hänsyn till vare sig 16S rRNA:s veckningsväg som är oberoende av r-proteiner eller den roll som nukleolytisk bearbetning av rRNA-prekursorer, som sker in vivo, spelar för sammansättningen av ribosomerna. På senare tid har dessa aspekter av sammansättningen av 30S-underenheten undersökts mer i detalj med hjälp av tekniker som kemisk och hydroxylradikalprovning av RNA-konformationen för att analysera förändringar i rRNP-konformationen med tiden och puls-chase/masspektrometri (PC/MS) för att bestämma kinetiken för r-proteinbindning till rRNA.
En möjlig förklaring till observationen av primärt bindande r-proteiner i samlingskartan är att deras bindningsställen åtminstone delvis skapas av den konformation som 16S rRNA antar oberoende av r-proteiner. I enlighet med denna idé och synen att ribosomer har utvecklats från en RNA-katalysator har det faktiskt visats att 5′-domänen av 16S rRNA kan veckas och bilda tertiära kontakter i frånvaro av alla r-proteiner. Denna tertiärstruktur är förmodligen inte helt stabil i avsaknad av proteinkontakter och stabiliseras därför troligen genom att r-proteiner binder sig till platser som skapas av övergående konformationer som rRNA antar när det genomgår veckning. Därför tyder den andra principen på att rRNA-veckning utgör grunden för r-proteinbindning under ribosomens sammansättning.
En tredje princip som har framkommit från in vitro-studier av bakteriella ribosomer är att en förstärkning av r-proteinbindningen med rRNA sker när ribosomens sammansättning fortskrider. Många r-proteiner kontaktar flera nukleotider på rRNA. Tidsupplöst hydroxylradikalfotavtryck har visat att vissa av dessa nukleotider skyddas före andra, vilket tyder på att när ribosombiogenesen fortskrider gör r-proteiner fler kontakter med rRNA och blir därmed mer stabilt integrerade med ribosomerna.
Den initiala etableringen av ett fåtal kontakter mellan r-proteiner och rRNA stabiliserar potentiellt vissa RNA-konformationer och inducerar förändringar i rRNA-konformationen för att tillhandahålla bindningsställen för ytterligare (sekundära eller tertiära) r-proteiner. Bindning av r-proteiner konsoliderar därför RNA-veckningsvinsterna och ger monteringsprocessen en riktning. Detta tyder på en modell där sammansättningen sker genom en omväxlande serie av RNA-konformationsförändringar och proteinbindning, som sekventiellt stabiliserar den slutliga RNA-strukturen. Kinetiska data har visat att sammansättningen av mogna 30S-underenheter sker via flera parallella RNA-faltningsvägar, som alla konvergerar mot slutprodukten. Detta har lett till konceptet om ett sammansättningslandskap i motsats till en unik väg över vilken sammansättningen av ribosomala underenheter sker.
För det sista har in vitro-studier avslöjat att sammansättningen av ribosomerna sker i 5′- till 3′-riktningen. PC/MS och kemisk sondering av rRNA:s sekundärstruktur har visat att r-proteinbindning till rRNA:s 5′-domän kan observeras innan proteinkontakter etableras med rRNA:s 3′-domän. Däremot visade hydroxylradikala fotspåranalyser en inledande explosion av nukleotidskydd längs hela 16S rRNA, vilket tyder på att RNA-veckning sker från många olika platser spridda över RNA, och därmed pekar på att det inte finns någon 5′- till 3′-riktning vid sammansättningen. Dessa motstridiga observationer kan förenas genom att man tar hänsyn till karaktären hos de olika experimentella uppställningarna. PC/MS mäter kinetiken för proteinbindning till rRNA, och som sådan kan endast stabila r-protein-rRNA-interaktioner detekteras eftersom r-proteiner som binder svagt under pulsen kan tvättas bort under jakten. Fotspårningsanalyser kan å andra sidan fånga nukleotidskydd av både svagt interagerande och stabilt associerade r-proteiner. Sammantaget tyder dessa data på att även om ribosomförening kan ske genom kärnbildning över hela rRNA, sker den slutliga täta associeringen av r-proteiner med rRNA i en 5′- till 3′-riktning.
Det är viktigt att överväga hur dessa in vitro-experiment kan eller inte kan avspegla föreningen in vivo. Till exempel, när ribosomens sammansättning sker in vivo är den kopplad till transkription av rRNA, vilket förmodligen också bidrar till den observerade 5′-till-3′-riktningen av r-proteinassocieringen. rRNA kan ha utvecklats så att det veckar sig 5′-till-3′ när det syntetiseras och inkorporerar r-proteiner på detta sätt, vilket kopplar sammansättningen till transkriptionen av rRNA. Dessutom tyder kravet på ett uppvärmningssteg under rekonstruktionen av ribosomala underenheter in vitro och identifieringen av ett antal bakteriella mutanter som är defekta när det gäller produktion av ribosomer på att det finns ett behov av trans-verkande faktorer under ribosombiogenesen in vivo.