Basofilaktiveringstest: matprovokation i ett provrör eller specialiserat forskningsverktyg?

Den gyllene standarden för diagnos av matallergi är oral matprovokation (OFC) . OFC kräver dock att det misstänkt skyldiga livsmedlet intas och kan orsaka en akut allergisk reaktion, som kan vara allvarlig . Därför måste OFC utföras i en övervakad miljö med utrustning och expertis för att behandla allergiska reaktioner och anafylaxi om de skulle inträffa. OFC kan orsaka stor oro hos patienter, föräldrar och till och med hos den kliniska personalen, eftersom det är förenat med stora risker. Diagnosen födoämnesallergi fastställs därför närhelst det är möjligt genom en nyligen inträffad övertygande historia av en IgE-medierad allergisk reaktion mot det skyldiga födoämnet i kombination med bevis på IgE-sensibilisering mot samma födoämne med hjälp av hudpricktest (SPT) och/eller serumspecifikt IgE (sIgE) . OFC är reserverat för de fall där resultaten av SPT och/eller sIgE är tvetydiga. Med ökad medvetenhet och ökad prevalens av födoämnesallergi och födoämnesöverkänslighet testas fler och fler patienter för födoämnesallergi. Avsaknaden av en historia av oral exponering för allergiframkallande livsmedel, som antingen resulterat i en allergisk reaktion eller i avsaknad av kliniska symtom, kan göra tolkningen av resultaten av SPT och sIgE särskilt utmanande. Spädbarn och småbarn som aldrig har ätit vissa allergiframkallande livsmedel utgör en betydande andel av de patienter som tas emot på allergikliniker och behöver ofta en OFC för att klargöra sin allergiska status. Detta leder till en ökad efterfrågan på OFC-undersökningar. Allergitjänsterna har svårt att tillgodose denna efterfrågan och patienterna kan behöva vänta flera månader innan de erbjuds en exakt diagnos av födoämnesallergi eller födotolerans av OFC, vilket kan leda till onödiga kostrestriktioner och betydande ångest i samband med den diagnostiska osäkerheten. OFC är också den bästa metoden för att bedöma om en födoämnesallergi har upphört, för att fastställa tröskeldosen och för att övervaka det kliniska svaret på immunmodulerande behandlingar av födoämnesallergi. I forskningsstudier måste allergiska patienter ofta genomgå upprepad OFC för att bedöma om det skett någon klinisk förbättring.

BAT, som är en funktionell test, har potential att mer likna patienternas kliniska fenotyp än allergitester som endast påvisar närvaron av allergenspecifikt IgE. Enkelt uttryckt kan BAT ses som en OFC i ett provrör, där basofiler som är inblandade i akuta allergiska reaktioner i stället för att ge ett barn maten genom munnen exponeras för ett livsmedelsextrakt i ett provrör. Trots analogin finns det skillnader mellan de två förfarandena och deras kliniska tillämpningar, och här uppstår frågan om BAT lojalt kan efterlikna guldstandarden OFC, dvs. om BAT in vitro kan reproducera den allergiska reaktion som sker in vivo vid en positiv OFC.

Basofilaktiveringstestet

BAT är ett flödescytometribaserat test där uttrycket av aktiveringsmarkörer mäts på ytan av basofiler efter stimulering med allergen -Fig. 1. Ett positivt basofilaktiveringstest kan ses som ett in vitro-surrogat för en akut allergisk reaktion in vivo. I en studie av patienter som är allergiska mot hymenoptera-gift observerades en uppreglering av basofila aktiveringsmarkörer både in vitro efter stimulering med gift från guljacka eller honungsbi och ex vivo efter en positiv stickprovokation . I samma studie fanns det en allmän överensstämmelse mellan den kliniska presentationen (systemisk reaktion kontra stor lokal reaktion) och resultaten av BAT, vilket tyder på att BAT är en potentiell biomarkör för anafylaxi. Även hos livsmedelsallergiska patienter fann man en god överensstämmelse mellan resultaten av BAT och resultatet av OFC. Hos alfa-galallergiska patienter med fördröjda allergiska reaktioner av omedelbar typ mot rött kött sammanföll aktiveringen av basofiler ex vivo i blod som samlats in vid olika tidpunkter med utvecklingen av systemiska allergiska reaktioner in vivo under OFC . Resultaten av denna studie stärker basofilernas roll i livsmedelsinducerade IgE-medierade allergiska reaktioner och anafylaxi.

Differentierade markörer på cellytan kan användas för att identifiera basofiler i helblod, inklusive IgE, CD123 (med HLA-DR), CCR3 eller CRTH2 (med CD3) eller CD203c .

I perifert blod påvisas IgE på basofiler, dendritiska celler, eosinofiler, monocyter, makrofager, B-celler och trombocyter, vilket innebär att det inte är specifikt för basofiler. CD123 är IL-3-receptorns underenhet med låg affinitet (α). Den uttrycks i höga nivåer på plasmacytoida dendritiska celler och basofiler och i låga nivåer på monocyter, eosinofiler, myeloida dendritiska celler och undergrupper av hematologiska progenitorceller. Ytterligare färgning med HLA-DR skiljer mellan HLA-DR-negativa basofiler och HLA-DR-positiva dendritiska celler och monocyter. CCR3 är receptorn för kemokiner av C-C-typ (t.ex. eotaxin, MCP och RANTES) och uttrycks i hög grad på basofiler och eosinofiler men också på Th1- och Th2-celler. CRTH2 är en annan markör som uttrycks av basofiler, eosinofiler och T-celler och kräver därför, liksom CCR3, en T-cellsmarkör, t.ex. CD3, för att skilja basofiler från T-celler. CD203c uttrycks konstitutivt och specifikt på basofiler och kan därför användas som en enskild identifieringsmarkör eller i kombination med andra markörer.

Efter stimulering med allergen uppregleras uttrycket av olika proteiner på basofils yta , nämligen CD63 och CD203c . CD63 är ett lysosomalt associerat membranprotein (LAMP) som inte uttrycks på ytan av vilande basofiler utan endast på granulernas membran inuti cellerna . När granulerna smälter samman med basofilernas plasmamembran under degranulering uttrycks CD63 på basofilernas yta . CD203c är ett enzym som klyver fosfodiester- och fosfosulfatbindningar och hydrolytiskt avlägsnar 5′-nukleotider successivt från 3′-hydroxyterminerna av oligonukleotider. Det uttrycks uteslutande och konstitutivt i låga nivåer på ytan av basofiler och mastceller och uttrycket ökar vid aktivering av cellerna. Markörer för basofilaktivering verkar bilda två olika grupper av markörer som uppregleras samtidigt: en som omfattar CD63, CD107a och CD107b och en annan som omfattar CD203c, CD13 och CD164 . CD63 och CD203c är de vanligaste basofila aktiveringsmarkörerna.

Laboratorieförfarandet för BAT består av tre steg: cellstimulering, cellfärgning och flödescytometri – fig. 1. Blodet bör behandlas så snart som möjligt efter blodprovstagningen, eftersom basofiler förlorar sin livskraft och reaktivitet med tiden. Studier har dock utförts med prover som förvarats vid +4 °C i upp till 24 timmar. En liten volym blod (ca 1-2 ml beroende på antalet förhållanden) krävs för BAT. Rå allergenextrakt eller renade eller rekombinanta allergener kan användas för cellstimulering. Olika allergenkoncentrationer bör användas, eftersom basofilernas känslighet för specifik allergenstimulering varierar mellan patienterna.

Resultaten av BAT kan bestämmas i termer av procentandel basofiler som uttrycker den definierade aktiveringsmarkören eller i termer av genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) genom att beräkna stimuleringsindexet, dvs. förhållandet mellan MFI för det valda villkoret och MFI för den negativa kontrollen. Det förstnämnda används vanligtvis för CD63 eftersom CD63 inte uttrycks i vilande celler och dess uttryck efter aktivering är bimodalt. Det senare används vanligen för CD203c som redan uttrycks i vilande celler och dess ökning efter allergenstimulering är unimodal-Fig. 2.

I allergiska patienter resulterar allergeninducerad basofilaktivering typiskt sett i en klockformad dos-respons-kurva, med ökande koncentrationer av allergenet (vanligen 5-6 logdifferens) som leder till en progressiv ökning av uttrycket av markörerna för basofilaktivering tills en platå nås-fig. 3.

Det finns en stor grad av variabilitet i den basofila responsen på allergen mellan individer. För att uttrycka denna heterogenitet och för att jämföra basofila svar mellan olika patienter kan olika parametrar bestämmas utifrån dos-respons-kurvan, t.ex. CD-max och EC50 (50 % effektiv koncentration) eller CDsens. CD-max är den maximala aktiveringen och motsvarar den maximala andelen aktiverade basofiler vid varje koncentration av allergen . EC50 är den effektiva dosen vid 50 % av den maximala aktiveringen och kan också representeras som CDsens. CDsens, som först beskrevs av Johansson, är den omvända delen av den halvmaximala effektiva koncentrationen, dvs. den koncentration vid vilken basofilaktiveringen är hälften av den maximala aktiveringen, gånger 100 och kan beräknas med hjälp av följande formel: CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax och CDsens är mått på basofil reaktivitet respektive basofil känslighet. Basofilreaktivitet kan definieras som graden av basofilaktivering, dvs. andelen aktiverade basofiler, och kan också mätas som andelen CD63-positiva basofiler vid olika allergenkoncentrationer eller som förhållandet mellan andelen CD63-positiva efter stimulering med allergen och med anti-IgE. Basofilkänslighet avser den koncentration av allergen vid vilken basofiler aktiveras och kan uttryckas som en procentandel av den maximala effektiva dosen (t.ex. EC5, EC10) förutom EC50 och CDsens, som tidigare nämnts. Figur 3 visar basofilresponsen hos två olika individer, den ena med högre basofilreaktivitet och -känslighet (blå) och den andra med lägre basofilreaktivitet och -känslighet (röd), dvs. med en mindre andel basofiler som aktiveras som svar på högre koncentrationer av allergenet. Shreffler och Patil har föreslagit en ny parameter för att mäta basofila reaktioner, arean under dosresponskurvan, som har fördelen att kombinera basofilreaktivitet och basofilkänslighet.

Användning av basofilaktiveringstestet för att diagnostisera födoämnesallergier

I en nyligen publicerad studie , utvärderade vi användbarheten av BAT för att diagnostisera jordnötsallergi i en välkaraktäriserad population av jordnötsallergiska, jordnötskänsliserade och icke-känsliga barn. BAT visade hög noggrannhet (97 %) vid diagnostisering av jordnötsallergi och möjliggjorde en minskning av antalet OFC som krävdes med 66 %. Vi validerade de diagnostiska gränsvärdena i en prospektivt och oberoende rekryterad population och BAT:s diagnostiska prestanda var fortfarande mycket god i denna andra studiepopulation. Under de senaste åren har andra studier bedömt BAT:s prestanda vid diagnostisering av allergi mot olika livsmedel, inklusive jordnötter, komjölk, ägg, vete, hasselnötter, skaldjur och persikor, samt vid diagnostisering av pollen-livsmedelssyndrom – tabell 1. Fallrapporter och små fallserier har visat att BAT också kan vara användbart för att diagnostisera allergi mot sesam och mot mindre vanliga utlösare av IgE-medierade livsmedelsallergiska reaktioner, t.ex. ris och kortkedjiga galakto-oligosackarider som finns i prebiotika . I ett nyligen publicerat ställningstagande från European Academy of Allergy and Clinical Immunology granskas de kliniska tillämpningarna av BAT.

Förskilda faktorer kan påverka den diagnostiska prestandan och BAT:s avgränsningsvärden i olika studier, varav vissa är relaterade till studiepopulationen, andra är relaterade till studiens utformning, andra är relaterade till laboratorieförfarandet och den metod som använts för dataanalyser – tabell 2. Befintliga studier är heterogena när det gäller de flesta av dessa aspekter, vilket begränsar deras jämförbarhet och en bredare tillämpning av de diagnostiska gränsvärden som fastställts i specifika studier. Kriteriet för att diagnostisera varje födoämnesallergi är allergenspecifikt och den diagnostiska noggrannheten kanske inte är densamma för olika allergener. Dessutom är de gränsvärden som fastställts för en population inte nödvändigtvis direkt överförbara till en annan population från ett annat geografiskt område som bedöms vid ett annat allergicentrum. En begränsning av BAT är att en liten andel av de testade patienterna har basofiler som inte reagerar (dvs. basofiler som reagerar på en icke-IgE-medierad positiv kontroll men inte på IgE-medierade stimulantia) och därför har ett ointerpreterbart resultat för testet. Ytterligare utmaningar när det gäller att överföra BAT från en forskningsmetod till ett diagnostiskt test i kliniken är relaterade till standardiseringen av testet och dess reproducerbarhet samt till kostnadseffektiviteten av att inkludera BAT i det diagnostiska tillvägagångssättet för patienter med misstänkt födoämnesallergi. Dessa aspekter har ännu inte fastställts och kräver ytterligare forskning.

Den metod som används för att utföra laboratorieförfarandet och för att analysera flödescytometridata kan ha en betydande inverkan på de resultat som erhålls för BAT och följaktligen på dess diagnostiska tillförlitlighet. Identifiering av basofiler med hjälp av en anti-IgE-antikropp kan t.ex. aktivera cellerna och förändra de resultat som erhålls med en annan metod för identifiering av basofiler. Uttrycket av vissa markörer för identifiering av basofiler, t.ex. CCR3 och CD123, kan förändras efter aktivering av basofiler. I en nyligen genomförd studie beskrev vi att hos ungefär en fjärdedel av patienterna kan uttrycket av CD123, som detekteras med flödescytometri, minska efter aktivering av basofiler och därför leda till en betydande förlust av aktiverade celler i förhållande till analyserna med hjälp av metoder som förlitar sig på denna markör för att identifiera basofiler. Detta kan leda till ett ökat antal feldiagnoser, särskilt falskt negativa, med viktiga konsekvenser för enskilda patienter. Genom att lägga till den basofilspecifika markören CD203c i gatingstrategin bibehölls cellantalet och antalet falskt negativa resultat kunde minskas (från 5 till 1 %). Den modifierade gatingstrategin förbättrade både känsligheten (från 88 till 98 %) och specificiteten (från 94 till 96 %) för BAT, vilket resulterade i en övergripande förbättring av BAT:s noggrannhet när det gäller att diagnostisera jordnötsallergi från 91 till 97 % (fig. 4). För att genomföra och tolka BAT på ett framgångsrikt sätt ligger ”djävulen i detaljerna”; därför är det mycket viktigt att noggrant överväga de metodologiska aspekterna av BAT.

Sammantaget har BAT som diagnostiskt test visat hög specificitet och positivt prediktivt värde. Vi validerade de diagnostiska cut-offs som fastställts för jordnötsallergi i en oberoende prospektivt rekryterad population och BAT:s specificitet och positiva prediktiva värde nådde 100 %. Den höga specificiteten är ett viktigt komplement till befintliga allergitest, såsom SPT och sIgE, som har hög känslighet men inte är särskilt specifika. Den höga specificiteten innebär att en positiv BAT bekräftar diagnosen födoämnesallergi med säkerhet, men att en negativ BAT inte nödvändigtvis utesluter diagnosen. Beroende på kostnadsnyttoförhållandet och säkerhetsaspekterna kan OFC göras hos patienter där BAT ger ett resultat som inte är entydigt (nämligen patienter med basofiler som inte svarar) eller hos patienter där BAT ger ett resultat som inte är entydigt och hos patienter där BAT var negativt.

Ansatsen för att besluta om behovet av OFC efter BAT beror också på hur resultatet av BAT betraktas i samband med resultaten av andra allergitester, antingen i kombination, när alla tillgängliga resultat beaktas samtidigt, eller sekventiellt, där BAT utförs endast hos patienter som hade tvetydiga eller diskordanta resultat för de andra allergitesterna. I vår tidigare nämnda jordnötsstudie jämförde vi resultatet av BAT med resultatet av andra allergitester som utfördes parallellt. BAT gav bättre resultat än SPT, specifikt IgE mot jordnöt och specifikt IgE mot Ara h 2 och andra jordnötskomponenter. Om man tar hänsyn till enskilda tester var BAT det mest exakta diagnostiska testet. För att utnyttja den tillgängliga informationen på bästa sätt kan resultaten av BAT användas i kombination med resultaten av andra tester . I allmänhet gäller dock att ju fler tester som används, desto större är den diagnostiska osäkerheten (och desto större är antalet OFC), eftersom olika tester kan ge motstridiga resultat. Bättre än att kombinera resultaten av allergitesterna samtidigt kan det vara att använda BAT efter varandra i den diagnostiska bearbetningen av födoämnesallergier hos patienter som inte har fått ett entydigt resultat på de andra allergitesterna . Detta tillvägagångssätt kan vara fördelaktigt även ur genomförbarhetssynpunkt, med tanke på de praktiska aspekterna av BAT, nämligen behovet av färskt blod och de resurser och den tekniska expertis som krävs. Det skulle inte vara praktiskt eller ens nödvändigt att utföra BAT på alla patienter som undersöks för misstänkt födoämnesallergi. BAT kan reserveras för utvalda fall, särskilt om det inte finns någon historia av oral exponering för livsmedlet eller om den kliniska historien är oklar och resultaten av SPT och specifikt IgE inte är entydiga . BAT kan användas som ett andra steg i det diagnostiska arbetet, efter klinisk historia och SPT och/eller sIgE, i svåra fall, innan man beslutar om huruvida en OFC krävs – fig. 5. Den diagnostiska noggrannheten och BAT:s överlägsenhet i förhållande till hudpricktest och specifikt IgE måste utvärderas med andra allergener och i andra kliniska miljöer.

Förutom att särskilja livsmedelsallergiska och livsmedelstoleranta patienter kan resultaten av BAT ge ytterligare information om egenskaperna hos livsmedelsinducerade reaktioner som kan vara till hjälp vid behandlingen av allergiska patienter . Olika parametrar i BAT har visat sig återspegla olika egenskaper hos de allergiska reaktionerna, där andelen aktiverade basofiler (basofilreaktivitet) återspeglar de allergiska symtomens svårighetsgrad och den dos vid vilken basofiler reagerar på allergen in vitro (basofilkänslighet) återspeglar den dos av livsmedelsprotein vid vilken patienterna reagerade under OFC . Dessa resultat för jordnötsallergi har återgivits i en senare publicerad studie och kan vara tillämpliga på andra födoämnesallergier. I vilket fall som helst bör resultatet av BAT beaktas i samband med andra kliniska särdrag och riskfaktorer för svårighetsgrad när man bedömer livsmedelsallergiska patienter.

Användning av basofilaktiveringstestet för att övervaka förvärv av tolerans mot livsmedel och det kliniska svaret på immunmodulerande behandlingar av matallergi

Reflekterar nära den kliniska fenotypen hos allergiska och toleranta patienter, BAT kan vara användbart för att bedöma den naturliga upplösningen av livsmedelsallergier som vanligtvis övervinns med tiden, t.ex. komjölk-, ägg- och veteallergier, och för att avgöra när patienterna ska utsättas för en ny utmaning för att bedöma om livsmedlet kan återinföras i kosten. BAT har visat sig kunna särskilja olika fenotyper av patienter med komjölk- och äggallergier, nämligen patienter som tolererar kraftigt uppvärmda former av dessa livsmedel samtidigt som de fortfarande reagerar på ouppvärmda livsmedel från patienter som reagerar på både kraftigt uppvärmd och ouppvärmd mjölk eller ägg .

BAT har också använts för att övervaka det kliniska svaret på immunmodulerande behandlingar av livsmedelsallergier i forskningsstudier. I studier av immunterapi mot livsmedel som jordnötter, komjölk och ägg har BAT generellt sett visat minskad basofilreaktivitet mot respektive livsmedelsallergen vid behandling, vilket är särskilt tydligt vid lägre koncentrationer av allergenet, vilket återspeglar minskad basofilkänslighet. Intressant nog visade Thyagarajan et al. att minskningen av basofilaktiveringen under jordnöts-OIT inte bara skedde som svar på jordnöt, utan även på äggallergenet (hos äggallergiker) och på anti-IgE men inte på den icke-IgE-medierade positiva kontrollen, fMLP (formyl-methionyl-leucylfenylalanin), vilket tyder på att vägen nedströms IgE-receptorn hade blivit anergisk. I en studie av omalizumab hos jordnötsallergiska patienter , minskade CD203c-uttrycket i BAT under behandlingen och återgick till nivåerna före behandlingen efter avslutad behandling. Slutligen visade det kinesiska växtbaserade läkemedlet FAHF-2 också en signifikant hämmande effekt på basofilresponsen hos patienter med allergi mot olika livsmedel parallellt med den kliniska förbättringen.

Tillsammantaget illustrerar dessa studier att BAT kan upprepas hos samma patienter över tid för att bedöma förändringarna i immunresponsen mot livsmedelsallergenerna med någon form av intervention, vare sig det rör sig om oral immunterapi, sublingual immunterapi, omalizumab eller andra immunmodulerande terapeutiska eller preventiva strategier.

Framtidsperspektiv

Med tanke på att tillämpa BAT för diagnos av matallergi i klinisk praxis behövs ytterligare forskning för att definiera och validera diagnostiska gränsvärden för specifika allergener och i olika patientpopulationer. Standardisering av laboratorieförfarandena skulle vara viktigt för att möjliggöra jämförbarhet av BAT-resultaten mellan olika centra. Detta skulle kräva standardisering av protokollet för in vitro-analysen och av flödescytometri- och dataanalysmetoderna. Användningen av liknande metoder för BAT skulle göra det möjligt att jämföra resultaten av BAT på olika centra, både för kliniska ändamål och för forskningsändamål, även i multicenterstudier.

När BAT väl har validerats på lämpligt sätt för att diagnostisera specifika födoämnesallergier kan BAT användas för att övervaka det kliniska svaret på immunmodulerande behandlingar, t.ex. allergenspecifik immunterapi och biologiska läkemedel. BAT har också en enorm potential för mekanistiska studier för att förbättra vår förståelse av basofilernas roll i immunmekanismerna vid födoämnesallergi och födotolerans.