Biosyntes av trans-4-hydroxyprolin genom rekombinanta stammar av Corynebacterium glutamicum och Escherichia coli

Konstruktion av trans-Hyp-producerande rekombinanta stammar

Det finns flera gener som spekuleras som putativ L-prolin 4-hydroxylas-gen i databasen, inklusive gener i Pseudomonas stutzeri, Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 och Dactylosporangium. sp. Med hjälp av PCR klonade vi och fick fram de putativa generna för P4H från P. stutzer och B. bronchiseptica RB50, som benämns p4hP och p4hB. De ligerades till motsvarande plasmider efter digestion och konverterades till C. glutamicum respektive E. coli. Längden på p4hP var 918 bps medan p4hB var 924 bps. Dessa sekvenser var till 100 % identiska med de rapporterade generna i NCBI. Genen för trans-P4H från Dactylosporangium sp. (p4hD) har uttryckts framgångsrikt i E. coli och kan omvandla L-prolin med goda enzymatiska egenskaper. Längden på p4hD var 816 bps som kodar för en polypeptid med 272 aminosyror och en molekylvikt på 29 715 dalton . I den här studien tillämpades p4hD med vissa modifieringar på kärnbaserna. Den ursprungliga gensekvensen för p4hD analyserades (http://www.kazusa.or.jp/codon/) och resultaten visade att det fanns några sällsynta kodoner för både C. glutamicum och E. coli. Det har rapporterats att sällsynta kodoner är starkt förknippade med låg nivå av proteinuttryck . Kodonoptimering för heterologt proteinuttryck har ofta visat sig drastiskt öka proteinuttrycket . De sällsynta kodonerna i p4hD-genen ersattes därför med de kodoner som används med hög frekvens i C. glutamicum och GC-innehållet justerades från 73 % till 61 % genom synonym konvertering, vilket låg nära C. glutamicums innehåll. Den modifierade genen för p4hD syntetiserades enligt ovanstående ändringar (Additional file 1).

Uttrycket av P4H är en av de viktiga aspekterna på uppbyggnaden av trans-Hyp biosyntetisk väg. Figur 2 visar SDS-PAGE av trans-P4Hs som uttrycks i rekombinant C. glutamicum och E. coli. Alla rekombinanta trans-P4H:er uttrycktes som lösliga proteiner utan inklusionskroppar. Det var uppenbart att de rekombinanta trans-P4H:erna i E. coli uttrycktes i mycket högre grad än de rekombinanta trans-P4H:erna i C. glutamicum (figur 2). Många faktorer påverkar uttrycket av främmande proteiner, bland annat promotorer, värd-vektorsystemet, kulturförhållanden osv. Eftersom det var den första som uttryckte trans-P4Hs i C. glutamicum, kommer mer omfattande studier såsom val av promotor och optimering av kulturbetingelser att övervägas i vårt framtida arbete.

Genomförande av P4H-aktiviteter

Oxygenaser används i stor utsträckning inom industrin eftersom de kan katalysera den mycket specifika oxyfunktionaliseringen av oaktiverade C-H-bindningar under milda förhållanden, särskilt genom att överföra molekylärt syre till ett substrat . P4H tillhör en familj av 2-oxosyraberoende dioxygenaser, som är ett monomeriskt protein och utnyttjar monomeriska snarare än polymera substrat . Aktiviteterna hos trans-P4H:er med hjälp av rekombinanta hela celler i denna studie mättes (tabell 1). Våra data visade att den uttryckta proteinnivån och den enzymatiska aktiviteten var högre vid 30 °C. Resultaten visade också att plasmiderna var mycket stabila eftersom plasmidstabiliteten hos rekombinanta E. coli- och C. glutamicum-stammar alla var mer än 98 % i slutet av fermenteringen.

De rekombinanta cellerna med uttryck av olika gener uppvisade olika nivåer av katalytisk aktivitet mot L-prolin. Aktiviteten hos trans-P4H uttryckt av E. coli BL21/ pET28a-p4hD var högst bland alla konstruerade rekombinanta stammar. De nya klonade och uttryckta generna från P. stutzeri och B. bronchiseptica visade också intressanta aktiviteter. När det gäller olika värdstammar var E. coli bättre än C. glutamicum, vilket kan ha samband med motsvarande plasmiders prestanda. Fyra L-prolinproducerande stammar av C. glutamicum användes som expressionsvärdstammar och de rekombinanta stammarna visade olika enzymatiska aktiviteter. Den högsta specifika enzymatiska aktiviteten bland C. glutamicum-stammarna var 40,7 U/mg våtcell av C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Den specifika enzymatiska aktiviteten hos rekombinant E. coli/pET28a -p4hD var dock upp till 60,4 U/mg våtcell. Tillväxten hos de tre rekombinanta E. coli-stammarna var likartad. Men det fanns en betydande skillnad mellan de rekombinanta stammarna av C. glutamicum. De rekombinanta C. glutamicum-stammarna med högre specifik enzymatisk aktivitet växte mindre än de med lägre specifik enzymatisk aktivitet. Dessutom var den enzymatiska aktiviteten hos E. coli BL21 /pET28a -p4hD likadan som hos E. coli W1485/pWFH1 och högre än hos E. coli BL21/pET24-p4h1 av . p4hD i E. coli W1485/pWFH1 var den ursprungliga hos Dactylosporangium sp., medan p4hD i E. coli BL21/pET24-p4h1 var modifierad. Även om kodonoptimeringen i den här studien utformades för C. glutamicum, visade resultaten att den också var framgångsrik i E. coli.

Trans-Hyp-produktion i kolvar

Produktionen av trans-Hyp av olika rekombinanta C. glutamicum- och E. coli-stammar visades också i tabell 1. Avkastningen av trans-Hyp från dessa rekombinanta stammar berodde både på den enzymatiska aktiviteten hos P4H och celltillväxten. E. coli BL21/ pET28a-p4hD hade den högsta avkastningen, vilket sammanföll med dess specifika enzymaktivitet. Även om de rekombinanta E. coli-stammarna växte på samma sätt i produktionsmediet fanns det betydande skillnader i produktionen av trans-Hyp som inte höll samma nivå med de specifika enzymaktiviteterna. Produktionen av trans-Hyp av rekombinanta C. glutamicum-stammar var också mycket mindre än den av E. coli BL21/pET28a-p4hD. Det berodde både på det lägre uttrycket av trans-P4H och den lägre celltillväxten i C. glutamicum. L-prolinproduktionen hos fyra C. glutamicum-stammar var också mindre än 1 g/L. Det var liten skillnad i trans-Hyp-produktion mellan de rekombinanta stammarna av C. glutamicum med samma gen p4hD, trots att vissa stammar hade bättre enzymprestanda och prolinproduktion.

Användning av de rekombinanta stammarna för att direkt syntetisera trans-Hyp från glukos via fermentation uppnåddes eftersom både de enzymer och prekursorer som behövdes i processen var tillgängliga. De överuttryckta utländska trans-P4Hs katalyserade hydroxyleringen av L-prolin i trans-4-positionen, medan 2-ketoglutarat tillfördes från glukos genom TCA-cykeln och sedan oxidativt dekarboxylerades till succinat (figur 1). Det rapporterades att prolin krävdes vid produktion av Hyp av rekombinant E. coli endast med p4h-gen. Kolet i prolin som tillsattes under jäsningen flödade endast till aminosyror som syntetiserades från intermediärer i TCA-cykeln och inte till glukoneogenes. Det ackumulerade Hyp var dock på en relativt hög nivå även utan tillsats av prolin i den här studien. Man kan förstå att Corynebacterium hade en kraftfull biosyntesväg för prolin . Den biosyntetiska vägen för prolin har också identifierats i E. coli, vilket kan bidra till syntesen av trans-Hyp i rekombinanta E. coli-stammar. Modifieringen av prolinvägen i E. coli ökade avkastningen av Hyp, medan bildandet av Hyp också kan lindra återkopplingshämningen av prolin . Mängden prolin (0-4 mM) främjade produktionen av trans-Hyp. Kontinuerlig tillsats av L-prolin förbättrade dock inte produktionsavkastningen nämnvärt (tabell 2). I den här studien var odlingstiden betydligt kortare än de som rapporterats i litteraturen, vilket kan tillskrivas de olika medierna som användes och som också indikerade att det fanns en stor potential med optimering. Faktum är att 2,28 g/L trans-Hyp producerades av rekombinant E. coli utan tillsats av L-prolin i kolvar med en liten modifiering av media och 6,72 g/L uppnåddes genom att komplettera endast 4 mM L-prolin.

För att ytterligare öka biosyntesen av trans-Hyp med rekombinant C. glutamicum och E. coli bör även alternativa metoder övervägas. I E. coli bör nedbrytningen av prolin övervinnas. Även om trans-Hyp-produktionen med en putA-mutant av E. coli inte förbättrades ytterligare, ökade avkastningen baserad på det använda prolinet avsevärt. I både C. glutamicum och E. coli är uttrycket av rekombinant P4H som en av oxygenaserna involverad i värdcellernas fysiologiska ämnesomsättning, inklusive cofaktor, co-substrat och syre. Utan en kraftfull prolin-syntesväg i E. coli kommer dessutom tillgängligheten och transporten av substratet att allvarligt begränsa omvandlingen.