Diagnostisk effekt av laboratorietester för ärftlig sfärocytos: En jämförande studie av 150 patienter grupperade enligt molekylära och kliniska egenskaper

Publicerat den av admin

Abstract

Bakgrund Laboratoriediagnosen av ärftlig sfärocytos bygger vanligen på NaCl-baserade eller glycerolbaserade osmotisk fragilitetstester för erytrocyter. På senare tid har det föreslagits ett test som är direkt inriktat på den molekylära defekten vid ärftlig sfärocytos (eosin-5′-maleimidbindande test). Inget av de tillgängliga testerna identifierar alla fall av ärftlig sfärocytos.Utformning och metoder Vi jämförde prestandan hos eosin-5′-maleimidbindningstestet, NaCl-osmotiska fragilitetsstudier på färskt och inkuberat blod, glycerollysetestet, det sura glycerollysetestet och Pink-testet på en serie av 150 patienter med ärftlig sfärocytos, grupperade enligt klinisk fenotyp och det defekta proteinet, med det slutgiltiga målet att hitta den kombination av tester som är förknippad med den högsta diagnostiska förmågan, även i de mildaste fallen av ärftlig sfärocytos.Resultat Eosin-5′-maleimidbindningstestet hade en känslighet på 93 % och en specificitet på 98 % för att upptäcka ärftlig sfärocytos. Känsligheten var oberoende av typen och omfattningen av den molekylära defekten och av den kliniska fenotypen. Det sura glycerollysetestet och Pink-testet uppvisade en jämförbar känslighet (95 % och 91 %). Känsligheten hos NaCl-testet för osmotisk fragilitet, som vanligen anses vara den gyllene standarden för diagnos av ärftlig sfärocytos, var 68 % på färskt blod och 81 % på inkuberat blod, och minskade ytterligare i kompenserade fall (53 % respektive 64 %). Kombinationen av eosin-5′-maleimidbindningstestet och syrat glycerollysetestet gjorde det möjligt att identifiera alla patienter med ärftlig sfärocytos. Det eosin-5′-maleimidbindande testet uppvisade den största sjukdomsspecificiteten.Slutsatser Varje typ av test misslyckas med att diagnostisera vissa fall av ärftlig sfärocytos. Kombinationen av ett eosin-5′-maleimidbindande test och ett syrat glycerollysetest gjorde det möjligt att identifiera alla patienter med ärftlig sfärocytos i denna serie och utgör därför en för närvarande effektiv diagnostisk strategi för ärftlig sfärocytos, inklusive lindriga/kompenserade fall.

Introduktion

Härdig sfärocytos är den vanligaste medfödda hemolytiska anemin hos kaukasier och drabbar ungefär 1 av 1000-2000 individer.1,2 Den molekylära defekten är mycket heterogen och involverar generna som kodar för spectrin, ankyrin, band 3 och protein 4.2,3 och graden av hemolys varierar kraftigt, från fullt kompenserad till transfusionsberoende anemi.

Det typiska laboratoriemärket för ärftlig sfärocytos, även om det inte är specifikt, är närvaron av sfärocyter på en perifer blodutstrykning, som kan påvisas hos 97 % av patienterna.4 Det kan dock finnas mycket få sfärocyter hos vissa patienter4,5 och det krävs därför skickliga operatörer för att upptäcka dem; dessutom är mikroskopisk undersökning av erytrocyter alltmer utelämnad i en tid av laboratorieautomatisering. Laboratoriediagnosen av ärftlig sfärocytos bygger därför vanligen på tester som utnyttjar förhållandet mellan yta och volym, som vanligtvis är reducerat i sfäriska erytrocyter, särskilt osmotisk bräcklighetstest av erytrocyter vid olika natriumkloridkoncentrationer (NaCl) på färskt och inkuberat blod6 och tester som mäter omfattningen av eller hastigheten för lysering av erytrocyter som är suspenderade i buffrade glycerollösningar, dvs.Glycerollysetest (GLT)7 , syrat glycerollysetest (AGLT)8 och Pink-testet9. Dessa tester upptäcker dock inte en varierande andel av fallen av ärftlig sfärocytos, särskilt inte de lindrigaste,6,10-12 och skiljer inte heller ärftlig sfärocytos från sekundär sfärocytos som är förknippad med andra tillstånd, främst autoimmuna hemolytiska anemier.13-15

Nyligen har kryohemolysetestet16,17 , som bygger på observationen att röda blodkroppar från patienter med ärftlig sfärocytos är särskilt känsliga för nedkylning vid 0 °C under hypertoniska förhållanden, och flödescytometrisk analys av eosin-5′-maleimid-märkta intakta röda blodkroppar (EMA-bindningstest)18 föreslagits som nya metoder för att identifiera ärftlig sfärocytos19 . Särskilt den sistnämnda metoden har visat sig vara ett känsligt och specifikt diagnostiskt test för ärftlig sfärocytos12,18,20-29 som är direkt inriktat på den strukturella skadan i denna sjukdom, eftersom den fluorescerande sonden, eosin-5′-maleimid, interagerar med proteinkomplexet band 3.30

Den tillgängliga direkta eller indirekta diagnostiska testens prestanda har oftast utvärderats individuellt och på ett begränsat antal fall. Testens känslighet varierar kraftigt och varje metod misslyckas med att identifiera flera patienter med ärftlig sfärocytos.4,6,12 I den här studien jämförde vi prestandan hos EMA-bindning, NaCl-inducerad osmotisk fragilitet hos färskt och inkuberat blod, GLT, AGLT och Pink-testet på en serie av 150 patienter med ärftlig sfärocytos grupperade enligt den kliniska fenotypen och den molekylära lesionen, med det slutliga målet att hitta den kombination av test som är förknippad med den högsta diagnostiska kraften för ärftlig sfärocytos, även för de lindrigaste fallen som vanligen är svåra att diagnostisera.

Design och metoder

Subjekt

Etthundrafemtio konsekutiva patienter med ärftlig sfärocytos (79 män och 71 kvinnor, medianålder 26 år, intervall 0-79 år) som tillhörde 128 obesläktade familjer undersöktes. Vid tidpunkten för studien var 22 patienter splenektomerade och 128 inte splenektomerade.

Alla patienter genomgick en klinisk och fysisk utvärdering och följande laboratorietester: komplett blodstatus, blodutstrykning, retikulocytantal, analyser av bilirubin- och haptoglobinkoncentrationen, bedömning av järnstatus, direkt antiglobulintest (DAT), screening för onormala eller instabila hemoglobiner, NaCl-osmotisk fragilitetstest på färskt och inkuberat blod, GLT, AGLT, Pink-test och EMA-bindningstest. I vissa fall undersöktes aktiviteten hos de viktigaste glykolytiska enzymerna och enzymerna i pentosfosfatvägen. Hos några få patienter utfördes även mitogenstimulerad DAT31 för att utesluta diagnosen DAT-negativ hemolytisk anemi.

Hereditär sfärocytos diagnostiserades på grundval av kliniska och laborativa tecken på kronisk hemolys, förekomst av sfärocyter vid perifer blodutstrykning, positivitet av minst ett fragilitetstest för erytrocyter, familjehistoria av ärftlig sfärocytos i förekommande fall, och uteslutande av andra orsaker till sekundär sfärocytos19. Anemi definierades som svår (Hb<8 g/dL), måttlig (Hb 8-10 g/dL), mild (Hb>10 och <11,5 g/dL för kvinnor och Hb>10 och <13,5 g/dL för män) och kompenserad (Hb>11,5 g/dL för kvinnor och >13,5 g/dL för män).

Prover från alla patienter genomgick natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) för analys av de röda cellmembranproteinerna och delades upp efter om det fanns brist på band 3, spektrin eller ankyrin, kombinerad spektrin/ankyrinbrist och ingen påvisbar defekt.4

Femhundrasjuttiofem friska blodgivare och 84 fall med annan hemolytisk anemi än ärftlig sfärocytos (17 med autoimmun hemolytisk anemi, 10 med störningar i enzymerna i de röda blodkropparna, 10 med ärftlig elliptocytos, 15 med medfödd dyserytropoetisk anemi, 9 med paroxysmal nattlig hemoglobinuri, 3 med stomatocytos, 3 med mekanisk anemi och 17 med anemi av okänd orsak) studerades också.

Hematologiska analyser

Perifert blod samlades in från patienter och kontroller under diagnostiska förfaranden efter att ha erhållit informerat samtycke och godkännande från Institutional Human Research Committee. De förfaranden som följdes var i enlighet med Helsingfors internationella etiska normer för experiment på människor. Den stora majoriteten av proverna samlades in vid vårt institut; prover som samlades in från andra centra skickades med bibehållen temperatur på 4 °C och behandlades alltid inom 24 timmar. Ingen av patienterna hade transfusionerats under de tre månaderna före studien. Hematologiska parametrar bestämdes på en automatiserad hematologianalysator (Automatic Beckman Coulter LH-750, CA, USA). Rutinmässiga hematologiska undersökningar utfördes enligt Dacie & Lewis.32 Bilirubin-, haptoglobin- och ferritinnivåerna bestämdes med Integra 800 (Roche, Mannheim, Tyskland). Antalet sfärocyter i perifert blod bedömdes av två oberoende och sakkunniga operatörer. Röda blodkroppars osmotiska bräcklighet utvärderades genom att utföra NaCl-testet för osmotisk bräcklighet på både färskt och inkuberat blod,6 standard GLT,7 AGLT8 och Pink-testet9 på prover från varje patient.

Testet för EMA-bindning utfördes enligt beskrivningen av King et al.18 med smärre modifieringar. I synnerhet bestämdes fluorescensintensiteten, uttryckt som medianfluorescens i kanalen, för 10 000 händelser i FL-1-kanalen med hjälp av en Becton Dickinson FACSCanto II flödescytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). EMA-färgämnenas stamlösning förvarades i små alikvots vid -80° C under en period av 6 månader. Testet utfördes en gång i veckan och grupperade alla fall under samma dag25 efter att ha bekräftat reproducerbarheten av resultaten på blodprover som förvarats upp till 6 dagar vid 4°C.

För att minska variationen inom testet jämfördes patienternas prover med proverna från sex normala kontroller. Resultaten uttrycktes som den procentuella minskningen av fluorescensen i patientprovet jämfört med medelfluorescensen hos de sex normala kontrollerna enligt Girodon et al.25 En ROC-kurva (receiver operating characteristic) baserad på logistisk regressionsanalys användes för att fastställa det optimala gränsvärdet mellan värden från patienter med hereditär sfärocytos och värden från normala individer. Enligt ROC-kurvanalysen var den optimala minskningen av fluorescensen för att skilja normala personer från patienter med ärftlig sfärocytos 11 %. Under dessa förhållanden var testspecificiteten beräknad på 575 friska personer 98 %.

Rödcellsspöken framställdes inom 24 timmar efter blodprovtagningen med hjälp av den metod som beskrivs av Dodge et al.33 med smärre modifieringar.4 Rödcellsmembranproteiner analyserades inom 15 dagar efter framställningen av spökena med hjälp av SDS-PAGE med hjälp av en 4 % till 12 % gradient av akrylamid enligt Fairbanks et al.34 och det diskontinuerliga buffertsystemet av Laemmli35 med en linjär gradient av akrylamid från 6 % till 14 %, enligt tidigare beskrivning.4 Aktiviteterna hos enzymer i de glykolytiska och pentosfosfatvägarna analyserades med de metoder som beskrivs av Beutler.36

Resultat

Tabell 1 visar de hematologiska och biokemiska uppgifterna hos patienterna med hereditär sfärocytos grupperade enligt om de inte hade splenektomiserats eller om de hade splenektomiserats före undersökningstillfället, och enligt den kliniska fenotypen (endast hos patienter som inte hade splenektomiserats). Majoriteten av de icke-splenektomerade personerna hade mild till kompenserad hemolys. 18 % hade mycket få sfärocyter (≤3 %). De vanligaste proteinavvikelserna var brist på spektrin och band 3 hos både icke-splenektomerade och splenektomerade patienter. Membranproteindefekten var odetekterbar hos nio (7 %) icke-splenektomerade försökspersoner, varav sju hade en positiv familjehistoria av ärftlig sfärocytos; de återstående två uppvisade mild anemi, retikulocytos och 5 % sfärocyter, i avsaknad av andra orsaker till kronisk hemolytisk anemi.

Tabell 2 jämför känsligheten hos de diagnostiska laboratorietesterna för ärftlig sfärocytos. EMA-bindning misslyckades med att identifiera 10/150 (7 %) fall (4 med band 3-brist, 5 med spektrinbrist och 1 med en oupptäckt defekt). Den genomsnittliga minskningen av fluorescensen var 27 % ± 10 % hos patienter med ärftlig sfärocytos jämfört med 0 % ± 8 % hos referenspersoner (P<0,001). Den procentuella fluorescensminskningen var direkt relaterad till antalet sfärocyter och indirekt till den genomsnittliga korpuskulära volymen; ingen korrelation hittades med hemoglobinkoncentrationen, det absoluta antalet retikulocyter eller bredden på fördelningen av röda blodkroppar. Testets känslighet var oberoende av typ och mängd av molekylär defekt, även om den var något lägre hos patienter med oupptäckta defekter som hade den minsta medianminskningen av fluorescensen (15 % jämfört med 30 % och 28 % vid band 3 respektive spektrinbrist). Det är värt att notera att känsligheten för EMA-bindningstestet var något högre hos splenektomerade än hos icke-splenektomerade patienter (figur 1).

Känsligheten för de olika undersökta analyserna av erytrocytfragilitet var mycket varierande och generellt sett högre hos splenektomerade än hos icke-splenektomerade patienter med hereditär sfärocytos, och lägre (med undantag för AGLT) hos patienterna med oupptäckta defekter än hos patienterna med påvisbara defekter (tabell 2A). När det gäller NaCl-testet för osmotisk bräcklighet var känsligheten större när det utfördes på inkuberat blod än på färskt blod. Överlag hade NaCl-testerna för osmotisk bräcklighet (både på färskt och inkuberat blod) en lägre känslighet än de mer vanligt förekommande glycerolbaserade testerna. Bland dessa sistnämnda tester hade AGLT den högsta känsligheten, även i fallen med oupptäckta defekter, jämförbar med EMA-bindningstestet.

Tabell 1. Hematologiska och biokemiska data för patienter med hereditär sfärocytos grupperade enligt om de hade eller inte hade splenektomiserats.

Alla patienter med ärftlig sfärocytos var positiva till minst två olika tester med undantag för två patienter (1 med band 3-brist och 1 med spektrinbrist) som endast var positiva till EMA-bindningstestet. Vi fann att kombinationen av EMA och AGLT gjorde det möjligt att identifiera alla patienter med ärftlig sfärocytos (tabell 2B). I synnerhet var 133/150 (88 %) av fallen av ärftlig sfärocytos EMA-positiva, AGLT-positiva, 7/150 (5 %) var EMA-positiva, AGLT-negativa och 10/150 (7 %) var EMA-negativa, AGLT-positiva.

När de olika testens prestanda analyserades hos icke-splenektomerade patienter som en funktion av den kliniska fenotypen bibehöll EMA-bindning, AGLT- och Pink-testet hög känslighet i de olika kliniska undergrupperna, medan känsligheten för NaCl osmotisk fragilitetstestet på färskt blod och efter inkubation sjönk markant i kompenserade fall (figur 1).

Resultaten av olika tester hos en serie på 84 patienter med andra hemolytiska tillstånd än ärftlig sfärocytos visas i figur 2. EMA-bindning visade den större sjukdomsspecificiteten och var negativ hos alla patienter med autoimmun hemolytisk anemi, även i närvaro av markerad sfärocytos.

Diskussion

Detta är den första omfattande jämförelsestudien av de mest använda laboratoriemetoderna för att diagnostisera ärftlig sfärocytos som används för närvarande och som har utförts på ett stort antal patienter som har grupperats enligt molekylär defekt, grad av hemolys och förekomst eller frånvaro av mjälte. Eftersom hälften av de undersökta patienterna hade mild/kompenserad anemi och därför var svårare att diagnostisera och 18 % hade mycket få sfärocyter på perifera blodutstryk, är den undersökta populationen särskilt lämplig för känslighetsstudier. Vi inkluderade inte kryohemolysetestet17 i den här studien eftersom grunden till att röda blodkroppar vid ärftlig sfärocytos är känsliga för kylning hittills inte har klarlagts, och åsikterna om dess rutinmässiga användning för diagnos av ärftlig sfärocytos är kontroversiella.4,5,16,17,19,37,38

Tabell 2. (A) Känslighet för enskilda tester hos patienter med ärftlig sfärocytos (HS) grupperade efter biokemisk defekt. (B) Känsligheten hos kombinerade tester i samtliga HS-fall. Siffran representerar förhållandet mellan positiva fall/totala fall med procentvärden inom parentes.

Figur 1. Känslighet för olika diagnostiska tester hos 22 splenectomerade och 128 icke splenectomerade patienter med hereditär sfärocytos (HS). Icke-splenektomerade patienter med HS delades in enligt klinisk fenotyp.

Av de diagnostiska metoder som övervägts är det nyligen föreslagna EMA-bindningstestet säkerligen det mest intressanta, och det används i allt större utsträckning av specialiserade laboratorier på grund av sin höga sensitivitet och specificitet.12,18,23-29 Denna metod riktar sig direkt mot sjukdomens strukturella skada, eftersom den fluorescerande sonden eosin-5′-maleimid interagerar med transmembranproteinerna band 3, Rh-protein, Rh-glykoprotein och CD47 som är reducerade i röda blodkroppar från patienter med ärftlig sfärocytos;30 defekter av andra cytoskeletala proteiner, såsom spectrin och protein 4.2, inducerar också en minskning av fluorescensintensiteten, troligen på grund av att de skapar en långväga modulationseffekt på färgämnesbindningsstället i band 3-protein.39 Känsligheten för EMA-bindningstestet i denna serie är högre än den som nyligen rapporterats av Crisp et al.,12 och liknar den som andra har funnit;18,23-29 dessutom verkar testets prestanda vara oberoende av typen av brist på röda cellmembranprotein och minskar endast något hos patienter med hereditär sfärocytos med en icke-detekterbar defekt, i linje med vad som observerats av King et al.,18 och Girodon et al.25 Intressant nog är känsligheten oberoende av den kliniska fenotypen, och är hög även hos patienter med kompenserad anemi. Den separata analysen av icke-splenektomerade och splenektomerade patienter med ärftlig sfärocytos visade att känsligheten ökade i den sistnämnda gruppen, ett resultat som generellt sett är gemensamt för alla undersökta tester. Denna observation pekar på behovet av att definiera patienternas kliniska egenskaper exakt när man testar diagnostiska metoders prestanda för ärftlig sfärocytos, och eventuellt att begränsa analysen till icke-splenektomerade personer. En ytterligare fördel med det EMA-bindande testet är att resultaten inte påverkas av transport eller lagring i upp till 6 dagar, vilket framgår av figur 3, vilket gör det möjligt att skicka prover som Girodon et al.25 rapporterat. Dessutom påverkas inte resultaten av nyligen genomförda transfusioner eftersom metoden diskriminerar olika populationer av röda blodkroppar.20

Figur 2. Resultat av enskilda diagnostiska tester hos patienter med andra hemolytiska anemier än hereditär sfärocytos (HS), jämfört med patienter med HS. Det skuggade området representerar normala referensintervall. CDA: kongenital dyserytropoetisk anemi; AIHA: autoimmun hemolytisk anemi; HE: ärftlig elliptocytos; PNH: När det gäller NaCl-testerna för osmotisk fragilitet fann vi att de inte lyckades identifiera nästan en fjärdedel av patienterna med ärftlig sfärocytos, vilket bekräftar resultat från andra forskare,12,13,19,40,41 och att deras sensitivitet generellt sett var lägre än de andra diagnostiska laboratorietesterna som utvärderades i den här serien. Trots detta anses inkuberad NaCl osmotisk fragilitet fortfarande allmänt som guldstandard för att diagnostisera ärftlig sfärocytos hos patienter med Coombs-negativa hemolytiska anemier5,11,42 . Analysen av litteraturen visar faktiskt att inga systematiska studier av känsligheten hos detta test har utförts tidigare och att påståendet att det är den bästa metoden för att diagnostisera ärftlig sfärocytos bygger på studier som utförts på ett begränsat antal patienter med inte klart definierade kliniska egenskaper; dessutom kan tolkningen av kurvorna för NaCl-osmotisk fragilitet vara svår i mindre typiska fall.8 Det stora antalet patienter i denna serie gjorde det möjligt för oss att korrelera NaCl osmotisk fragilitetstestets prestanda med sjukdomens kliniska uttryck: observationen att i fall av kompenserad ärftlig sfärocytos minskade känsligheten hos osmotisk fragilitetstest till nästan 60 %, vilket är mycket mer än vad som rapporterades av Korones & Pearson,13 begränsar ytterligare användbarheten av denna metod i de lindrigaste och mindre typiska fallen. Detta bekräftas också av att känsligheten sjunker till 30 % hos patienter med hereditär sfärocytos med en odetekterbar biokemisk defekt.

De glycerolbaserade erytrocytfragilitetstesterna, med undantag för originalversionen GLT, är känsligare än det osmotiska NaCl-fragilitetstestet; i synnerhet i den här serien hade AGLT en känslighet på 95 %, vilket liknar det som andra har funnit1,15,43,44 och är högre än det som rapporterats av Cynober m.fl.10 . och Bucx et al.45 Känsligheten för AGLT var också hög i kompenserade fall och i fall med en oupptäckt biokemisk defekt. Dessutom är det värt att notera att AGLT identifierade de tio EMA-negativa fallen av ärftlig sfärocytos.

Kombinationen av EMA-bindning och AGLT gjorde det möjligt att identifiera alla fall av ärftlig sfärocytos i denna serie; eftersom flödescytometrar inte finns tillgängliga på alla diagnostiska laboratorier är det värt att nämna att AGLT plus NaCl osmotisk fragilitetstest på inkuberat blod höjer den diagnostiska sensitiviteten till 97 %, vilket är likvärdigt med vad som tidigare har rapporterats i en större serie av patienter4: Detta värde är i alla fall högre än det värde som erhålls genom att kombinera EMA-bindning och kryohemolysetestet, vilket nyligen rapporterades av Crisp et al.12

Figur 3.(A) Medelvärden för kanalfluorescens hos normala kontroller och patienter med hereditär sfärocytos (HS) vid olika förvaringsdagar. (B-C) Resultat av EMA-bindningstest i prover från 150 HS-patienter grupperade enligt leverans (B) och förvaringsdagar före testning (C). ■ Kontroller, – HS ej expedierad, ○ HS expedierad.

Figur 4. Flödesschema för laboratoriediagnostik av hereditär sfärocytos (HS).

Sjukdomsspecificiteten hos de diagnostiska testerna för ärftlig sfärocytos utvärderades genom att inkludera en stor grupp patienter med olika typer av hemolytisk anemi som kan uppvisa morfologiska och laboratorieegenskaper som liknar dem för ärftlig sfärocytos. Som väntat var resultaten av EMA-bindning, i form av procentuell fluorescensminskning, direkt relaterade till antalet sfärocyter endast hos patienter med ärftlig sfärocytos, men inte hos patienter med autoimmun hemolytisk anemi, inte ens hos dem med uttalad sfärocytos: denna iakttagelse stämmer överens med den höga sjukdomsspecificitet hos detta test som rapporterats av andra19.-21,25 Vi fann att de andra testerna, särskilt de glycerolbaserade, är mindre specifika än EMA-bindning, eftersom de, som tidigare rapporterats,8,9,14,15,46 ofta är positiva även vid förvärvade hemolytiska anemier. Det är värt att nämna att inget av de tillgängliga diagnostiska testerna för ärftlig sfärocytos, vare sig direkta eller indirekta, skiljer ärftlig sfärocytos från medfödd dyserytropoetisk anemi typ II. Den sistnämnda sjukdomen är visserligen mindre vanlig än ärftlig sfärocytos, men kan likna den kliniska presentationen, morfologin hos de röda blodkropparna och den ökade osmotiska bräckligheten hos de röda blodkropparna vid ärftlig sfärocytos och kan kräva SDS-PAGE-analys för att kunna identifieras: Mariani et al. rapporterade att 13 % av de fall som hänvisades till ett referenslaboratorium med den provisoriska beteckningen hereditär sfärocytos visade sig vara medfödd dyserytropoetisk anemi typ II när de undersöktes med SDS-PAGE.47

De diagnostiska riktlinjerna för ärftlig sfärocytos från British Committee for Standards in Hematology,19 de enda hittills tillgängliga, rekommenderar antingen EMA-bindning eller kryohemolysetestet som screeningmetod,16 den avgörande faktorn för valet är tillgången till en flödescytometer. Riktlinjerna anger inte om båda testerna ska utföras vid tvetydiga eller gränsfall. I vilket fall som helst ger även kombinationen av dessa två tester en sensitivitet på 93 %, vilket liknar känsligheten för EMA-bindning eller AGLT som används ensamma, och är mycket lägre än den som erhålls genom kombinationen av EMA-bindning plus AGLT.

Som framgår av figur 4, i närvaro av en patient med DAT-negativ kronisk hemolys med sfärocyter, gör negativiteten för både EMA och AGLT det möjligt att utesluta ärftlig sfärocytos. Positivitet för EMA-bindning (med antingen positiv eller negativ AGLT) leder till diagnosen ärftlig sfärocytos utom i de icke-dominanta fall med otillräcklig retikulocytos11 som behöver SDS-PAGE-analys för att utesluta medfödd dyserytropoetisk anemi typ II. SDS-PAGE-analys kan också krävas i de sällsynta EMA-negativa, AGLT-poistiva fallen med negativ familjehistoria, på grund av AGLT:s lägre sjukdomsspecificitet.

Sammanfattningsvis kan inget enskilt test identifiera alla fall av ärftlig sfärocytos. Kombinationen av EMA-bindning, som direkt riktar sig mot den strukturella defekten vid ärftlig sfärocytos, och AGLT, som utnyttjar förhållandet mellan röda blodkroppars yta och volym, gjorde det möjligt för oss att identifiera alla patienter med ärftlig sfärocytos i den här serien och utgör därför en mycket effektiv diagnostisk strategi för ärftlig sfärocytos även i milda/kompenserade fall. Det måste dock understrykas att diagnosen ärftlig sfärocytos är det sista steget i ett diagnostiskt arbete som inte bara bygger på laboratorietester utan också på klinisk undersökning, personlig familjehistoria och uteslutande av möjliga orsaker till sekundär sfärocytos.

Fotnoter

  • Finansiering: Detta arbete stöddes av ett bidrag från stiftelsen IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico i Milano, RC2009 160/01 och ENERCA III-projektet, EC 2008, konvention nr 210.
  • Författare och upplysningarFörfattarnas information om bidrag från personer som anges som författare och i erkännanden finns tillgänglig tillsammans med den fullständiga texten av denna artikel på www.haematologica.org.
  • Finansiella och andra upplysningar som författarna lämnat med hjälp av ICMJE:s (www.icmje.org) Uniform Format for Disclosure of Competing Interests finns också tillgängliga på www.haematologica.org.
  • Received August 4, 2011.
  • Revisionen mottogs den 11 oktober 2011.
  • Antagen den 26 oktober 2011.
  1. Eber SW, Pekrun A, Neufeldt A, Schröter W. Prevalens av ökad osmotisk bräcklighet hos erytrocyter hos tyska blodgivare: screening med hjälp av ett modifierat glycerollysetest. Ann Hematol. 1992; 64(2):88-92. PubMedhttps://doi.org/10.1007/BF01715351Google Scholar
  2. Tse WT, Lux SE. Störningar i de röda blodkropparnas membran. Br J Haematol. 1999; 104(1):2-13. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1999.01130.xGoogle Scholar
  3. Gallagher PG. Störningar i de röda blodkropparnas membran. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005;13-8. Google Scholar
  4. Mariani M, Barcellini W, Vercellati C, Marcello AP, Fermo E, Pedotti P. Kliniska och hematologiska egenskaper hos 300 patienter som drabbats av ärftlig sfärocytos grupperade enligt typen av membranproteinfel. Haematologica. 2008; 93(9):1310-7. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.12546Google Scholar
  5. Hematology of infancy and childhood. Saunders: Philadelphia; 2009. Google Scholar
  6. Parpart AK, Lorenz PB, Parpart ER, Gregg JR, Chase AM. Den osmotiska resistensen (bräckligheten) hos mänskliga röda blodkroppar. J Clin Invest. 1947; 26(4):636-40. PubMedhttps://doi.org/10.1172/JCI101847Google Scholar
  7. Gottfried EL, Robertson NA. Glycerollystid för inkuberade erytrocyter vid diagnos av ärftlig sfärocytos. J Lab Clin Med. 1974; 84(5):746-51. PubMedGoogle Scholar
  8. Zanella A, Izzo C, Rebulla P, Zanuso F, Perroni L, Sirchia G. Acidified glycerol lysis test: ett screeningtest för sfärocytos. Br J Haematol. 1980; 45(3):481-6. PubMedGoogle Scholar
  9. Vettore L, Zanella A, Molaro GL, De Matteis MC, Pavesi M, Mariani M. Ett nytt test för laboratoriediagnostik av sfärocytos. Acta Haematol. 1984; 72(4):258-63. PubMedGoogle Scholar
  10. Cynober T, Mohandas N, Tchernia G. Red cell abnormalities in hereditary spherocytosis: relevance to diagnosis and understanding of the variable expression of clinical severity. J Lab Clin Med. 1996; 128(3):259-69. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-2143(96)90027-XGoogle Scholar
  11. Perrotta S, Gallagher PG, Mohandas N. Hereditär sfärocytos. Lancet. 2008; 372(9647):1411-26. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0140-6736(08)61588-3Google Scholar
  12. Crisp RL, Solari L, Vota D, García E, Miguez G, Chamorro ME. En prospektiv studie för att bedöma det prediktiva värdet för ärftlig sfärocytos med hjälp av fem laboratorietester (kryohemolysetest, eosin-5′-maleimidflödescytometri, osmotisk fragilitetstest, autohemolysetest och SDS-PAGE) på 50 familjer med ärftlig sfärocytos i Argentina. Ann Hematol. 2011; 90(6):625-34. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s00277-010-1112-0Google Scholar
  13. Korones D, Pearson HA. Normal erytrocyt osmotisk bräcklighet vid ärftlig sfärocytos. J Pediatr. 1989; 114(2):264-6. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0022-3476(89)80794-2Google Scholar
  14. Apel D, Maria ska B, Maj S. Diagnostic value of acidified glycerol lysis test (AGLT) in hereditary spherocytosis and selected hematologic diseases. Acta Haematol Pol. 1993; 24(3):267-71. PubMedGoogle Scholar
  15. Brabec V, Marík T, Feixová H, Slavíková V. Nya tester för laboratoriediagnos av sfärocytos. Vnitr Lek. 1991; 37(11-12):883-7. PubMedGoogle Scholar
  16. Iglauer A, Reinhardt D, Schröter W, Pekrun A. Cryohemolysis test as a diagnostic tool for hereditary spherocytosis. Ann Hematol. 1999; 78(12):555-7. PubMedhttps://doi.org/10.1007/s002770050557Google Scholar
  17. Streichman S, Gescheidt Y. Cryohemolysis for the detection of hereditary spherocytosis: correlation studies with osmotic fragility and autohemolysis. Am J Hematol. 1998; 58(3):206-12. PubMedhttps://doi.org/10.1002/(SICI)1096-8652(199807)58:3<206::AID-AJH8>3.0.CO;2-VGoogle Scholar
  18. King MJ, Behrens J, Rogers C, Flynn C, Greenwood D, Chambers K. Snabbt flödescytometriskt test för diagnostik av membrancytoskeletonassocierad hemolytisk anemi. Br J Haematol. 2000; 111(3):924-33. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02416.xGoogle Scholar
  19. Bolton-Maggs PH, Stevens RF, Dodd NJ, Lamont G, Tittensor P, King MJ, Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol. 2004; 126(4):455-74. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2004.05052.xGoogle Scholar
  20. King MJ, Telfer P, MacKinnon H, Langabeer L, McMahon C, Darbyshire P, Dhermy D. Användning av eosin-5-maleimidbindningstestet vid differentialdiagnostik av hereditär sfärocytos och hereditär pyropoikilocytos. Cytometry B Clin Cytom. 2008; 74(4):244-50. PubMedGoogle Scholar
  21. King MJ, Bruce L, Whiteway A. Det muterade erytrocytband 3-proteinet i sydostasiatisk ovalocytos binder inte eosin-5-maleimid. Int J Lab Hematol. 2009; 31(1):116-7. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2007.01019.xGoogle Scholar
  22. King MJ, Jepson MA, Guest A, Mushens R. Detection of hereditary pyropoikilocytosis by the eosin-5-maleimide (EMA)-binding test is attributable to a marked reduction in EMA-reactive transmembrane proteins. Int J Lab Hematol. 2011; 33:205-211. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2010.01270.xGoogle Scholar
  23. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, Ghosh K, Mohanty D. Experience with eosin-5′-maleimid as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol. 2003; 25(6):373-6. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.0141-9854.2003.00557.xGoogle Scholar
  24. Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, Baumann E, Linss W. Flödescytometri som ett diagnostiskt verktyg för ärftlig sfärocytos. Acta Haematol. 2006; 116(3):186-91. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000094679Google Scholar
  25. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, Largier M, Delaunay J, Fénéant-Thibault M. Usefulness of the eosin-5′-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of hereditary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol. 2008; 140(4):468-70. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06944.xGoogle Scholar
  26. Kar R, Mishra P, Pati HP. Utvärdering av eosin-5-maleimidflödescytometriskt test vid diagnos av ärftlig sfärocytos. Int J Lab Hematol. 2010; 32(1 Pt 2):8-16. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1751-553X.2008.01098.xGoogle Scholar
  27. Riley CH, Nikolajsen K, Kjaersgaard E, Klausen TW, Mourits-Andersen T, Clausen N, Lausen B, Rosthøj S, Birgens H. Flödescytometrisk diagnostik av ärftlig sfärocytos. Ugeskr Laeger. 2009; 171(49):3610-4. PubMedGoogle Scholar
  28. D’Alcamo E, Agrigento V, Sclafani S, Vitrano A, Cuccia L, Maggio A. Reliability of EMA binding test in the diagnosis of hereditary spherocytosis in Italian patients. Acta Haematol. 2011; 125(3):136-40. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000322253Google Scholar
  29. Tachavanich K, Tanphaichitr VS, Utto W, Viprakasit V. Snabbt flödescytometriskt test med användning av eosin-5-maleimid för att diagnostisera sjukdomar i röda blodkroppsmembran. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009; 40(3):570-5. PubMedGoogle Scholar
  30. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimidbindning till band 3 och Rh-relaterade proteiner utgör grunden för ett screeningtest för ärftlig sfärocytos. Br J Haematol. 2004; 124(1):106-13. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2003.04730.xGoogle Scholar
  31. Barcellini W, Clerici G, Montesano R, Taioli E, Morelati F, Rebulla P, Zanella A. In vitro-kvantifiering av produktionen av antikroppar mot röda blodkroppar vid idiopatisk autoimmun hemolytisk anemi: effekt av mitogen- och cytokinstimulering. Br J Haematol. 2000; 111(2):452-60. PubMedhttps://doi.org/10.1046/j.1365-2141.2000.02380.xGoogle Scholar
  32. Dacie JV, Lewis SM. Praktisk hematologi. Churchill Livingston: London; 2001. Google Scholar
  33. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan Dj. Framställning och kemiska egenskaper hos hemoglobinfria spöken av mänskliga erytrocyter. Arch Biochem Biophys. 1963; 100:119-30. PubMedhttps://doi.org/10.1016/0003-9861(63)90042-0Google Scholar
  34. Fairbanks G, Steck TL, Wallach DF. Elektroforisk analys av de viktigaste polypeptiderna i det mänskliga erytrocytmembranet. Biochemistry. 1971; 10(13):2606-17. PubMedhttps://doi.org/10.1021/bi00789a030Google Scholar
  35. Laemmli UK. Klyvning av strukturella proteiner under sammansättningen av huvudet på bakteriofag T4. Nature. 1970; 227(5259):680-5. PubMedhttps://doi.org/10.1038/227680a0Google Scholar
  36. Beutler E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. Grune &amp; Stratton Inc: New York, NY; 1984. Google Scholar
  37. Iolascon A, Avvisati RA. Korrelation mellan genotyp och fenotyp vid ärftlig sfärocytos. Hematologica. 2008; 93(9):1283-8. PubMedhttps://doi.org/10.3324/haematol.13344Google Scholar
  38. Romero RR, Poo JL, Robles JA, Uriostegui A, Vargas F, Majluf-Cruz A. Usefulness of cryohemolysis test in the diagnosis of hereditary spherocytosis. Arch Med Res. 1997; 28(2):247-51. PubMedGoogle Scholar
  39. Golan DE, Corbett JD, Korsgren C, Thatte HS, Hayette S, Yawata Y, Cohen CM. Kontroll av band 3:s laterala och roterande rörlighet av band 4.2 i intakta erytrocyter: frisättning av band 3-oligomerer från bindningsställen med låg affinitet. Biophys J. 1996; 70(3):1534-42. PubMedhttps://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79717-5Google Scholar
  40. Godal HC, Gjønnes G, Ruyter R. Bidrar förinkubation av de röda blodkropparna till förmågan hos det osmotiska fragilitetstestet att upptäcka mycket milda former av ärftlig sfärocytos? Scand J Haematol. 1982; 29(1):89-93. PubMedGoogle Scholar
  41. Praktisk hematologi. Churchill Livingstone; 1991. Google Scholar
  42. Iolascon A, Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Alloisio N, Morlé L, Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects. Haematologica. 1998; 83(3):240-57. PubMedhttps://doi.org/10.1159/000015191Google Scholar
  43. Mittler U, Radig K, Kluba U, Aumann V, Röppnack R. Experience with the glycerol lysis test in acid medium in diagnosis of hereditary spherocytosis. Kinderarztl Prax. 1993; 61(6):219-22. PubMedGoogle Scholar
  44. Hoffmann JJ, Swaak-Lammers N, Breed WP, Strengers JL. Diagnostisk användbarhet av det förinkuberade sura glycerollysetestet vid hemolytiska och icke hemolytiska anemier. Eur J Haematol. 1991; 47(5):367-70. PubMedGoogle Scholar
  45. Bucx MJ, Breed WP, Hoffmann JJ. Jämförelse av acidified glycerol lysis test, Pink test och osmotic fragility test vid hereditär sfärocytos: effekt av inkubation. Eur J Haematol. 1988; 40(3):227-31. PubMedGoogle Scholar
  46. Rutherford CJ, Postlewaight BF, Hallowes M. An evaluation of the acidified glycerol lysis test. Br J Haematol. 1986; 63(1):119-21. PubMedhttps://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1986.tb07501.xGoogle Scholar
  47. Mariani M, Vercellati C, Bianchi P, Marzorati S, Caneva L, Soligo C. Congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II) mimicking hereditary spherocytosis (HS): report of 12 cases detected by SDSPAGE. Hematol J. 2002; 3:353. Google Scholar

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.