Effektiv produktion av 3-hydroxipropionsyra från glycerol med metaboliskt modifierad Klebsiella pneumoniae

Vid produktion av 1,3-propandiol eller 3-HP från glycerol är mjölksyra den viktigaste biprodukten, vilket avsevärt minskar produktutbytet. Därför har man försökt minska laktatproduktionen genom deletion av den gen som kodar för laktatdehydrogenas (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Eftersom båda reaktionerna som bildar 1,3-propandiol och 3-HP konkurrerar om det gemensamma substratet 3-hydroxyaldehyd (3-HPA), gynnar deletion av propandioloxidoreduktas produktion av 3-HP (Ashok et al. 2011). I den här studien slogs därför generna ldhA och dhaT ut för att öka 3-HP-produktionen.

Effekt av ldhA-brist på 3-HP-produktion

Den ldhA-bristande stammen JJQ01 konstruerades och knockout av ldhA bekräftades som visas i figur S2A. De rekombinanta stammarna Kp4(pUC18-kan-aldH) och JJQ01(pUC18-kan-aldH) konstruerades och fermenteringar med matad batch genomfördes i 5-L-bioreaktorn. Profilerna för celltillväxt, glycerolförbrukning och produktion av metaboliter visas i figur 2a och b. Kp4(pUC18-kan-aldH) producerade 18,3 g/L 3-HP med en avkastning på 0,21 mol/mol på 38 timmar, medan mjölksyra nådde 32,2 g/L med en högre avkastning på 0,34 mol/mol. Dessutom producerades 17,6 g/L 2,3-butandiol, 6,1 g/L 1,3-propandiol och 10,7 g/L ättiksyra. Bildandet av laktat ökar inte bara kostnaden utan också svårigheten att återvinna 3-HP, som är en isomer av laktat. Dessutom är laktat en viktig hämmare av biosyntesen av 3-HP och 1,3-propandiol (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). Brist på ldhA eliminerade effektivt laktatbildningen och 3-HP-produktionen nådde 48,3 g/L med en avkastning på 0,28 mol/mol, vilket visas i fig. 2b. Koncentrationen och utbytet av 3-HP i denna ldhA-bristande stam ökade med 1,64 gånger respektive 33,3 % jämfört med Kp4(pUC18-kan-aldH)-stammen. Förutom den lilla mängden etanolbildning (cirka 4 g/L) upptäcktes inte ackumuleringen av pyruvat och formiat av ldhA-mutantstammen, vilket nästan inte observerades när man använde vildtypstammen.

Dessa resultat visade tydligt att blockering av mjölksyraproduktionen i hög grad omdirigerade kolflödet till 3-HP-produktion. Glycerolassimilering genom DhaB förbättrades avsevärt, nästan 0,4 mol/mol glycerol styrdes genom DhaB till 3-HPA, vilket överensstämde med andra studier (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). En minskning av laktat kunde sänka toxiciteten för cellerna, gynnade celltillväxten och produktiviteten av 3-HP. Reduktion av laktat ökade dock också bildningen av 2,3-butandiol och 1,3-propandiol, som nådde 21,9 g/L med en avkastning på 0,13 mol/mol respektive 18,5 g/L med en avkastning på 0,12 mol/mol. På grund av ldhA-deletion kan överskott av NADH som härrör från ökad 3-HP-ackumulering främja produktion av 2,3-butandiol och 1,3-propandiol i stället för laktat för att regenerera NAD+ och upprätthålla redoxbalansen. Faktum är att bildandet av etanol också stödde regenerering av NAD+, vilket resulterade i högre flöde från pyruvat till etanol än flödet till pyruvat.

Effekt av dhaT-brist på 3-HP-produktion

Deletion av ldhA ökade dramatiskt 3-HP-produktionen, samtidigt som produktionen av 1,3-propandiol också ökades till 18,5 g/L. Ko et al. (2017) rapporterade att 43 g/L 3-HP och 21 g/L 1,3-propandiol erhölls genom att reducera acetat och andra biprodukter. Även om bildandet av 1,3-propandiol gynnar glycerolutnyttjandet genom att regenerera kofaktorn står det för en betydande del av glycerolkolflödet. Eftersom 1,3-propandiol och 3-HP konkurrerar om samma prekursor 3-HPA, för att begränsa flödet till 1,3-propandiol, konstruerades ldhA- och dhaT-dubbelknockoutstammen (visas i Additional file 1: Figur S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). Resultaten av matad batch-fermentering i 5-L-reaktorn visas i figur 2c. Oväntat nog resulterade samtidig knockout av ldhA och dhaT endast i 44,5 g/L 3-HP, även om utbytet ökade till 0,32 mol/mol glycerol. Deletion av dhaT resulterade i minskad 1,3-propandioltiter och avkastning till 9,9 g/L respektive 0,07 mol/mol. Men 1,3-propandiol producerades fortfarande i den reaktion som katalyseras av YqhD och andra oxidoreduktas (Ashok et al. 2013). Jämfört med JJQ01(pUC18-kan-aldH) ökade dessutom produktionen av 2,3-butandiol något från 21,9 till 23,4 g/L, vilket tyder på att flödet till 2,3-butandiolvägen ökade för att konsumera det överskott av NADH som härrör från den ALDH-katalyserade reaktionen. 1,3-propandiolsyntesen spelar en nyckelroll i regleringen av redoxbalansen i K. pneumoniae. Inom oxidationsvägen producerar bildandet av en molekyl acetat från glycerol tre molekyler NADH, samtidigt som en molekyl ATP bildas. Följaktligen minskade deletion av både ldhA och dhaT kraftigt förmågan till NAD+-regenerering, och mer NADH oxiderades genom bildning av 2,3-butandiol, vilket resulterade i ökad 2,3-butandiol. En minskning av luftningshastigheten (begränsning av syretillförseln) kunde öka acetatproduktionen för att ge mer ATP, men samtidigt bildades mer NADH, vilket resulterade i ytterligare ökad produktion av 2,3-butandiol. Det regenererade NAD+ verkade dock vara mindre än det som bildades i den reaktion som katalyseras av DhaT, vilket ledde till lägre 3-HP-produktion. Därför är tillförsel av lämplig mängd syre för att generera NAD+ utan att påverka DhaB-aktiviteten och glycerolupplösningen avgörande för 3-HP-produktionen i mikro-aerob fermentering.

I den här studien har man inte lyckats förbättra 3-HP genom att ta bort dhaT-genen. Glyceroldissimilationen regleras av glyceroldeshydrogenas DhaD, glycerolkinas GlpK, glyceroldeshydratas DhaB och 1,3-propandioloxidoreduktas 1,3-PDORs. Glycerolförgreningens stelhet innebär att det är svårt att förbättra 3-HP-produktionen genom att ta bort gener som är involverade i fördelningen av glycerolflödet. Ashok et al. (2011) hade bestämt de inneboende aktiviteterna hos DhaD, DhaB, ALDH och 1,3-PDORs efter radering av dhaT-genen. De fann att DhaD:s aktivitet förbättrades något, ALDH:s aktivitet minskade något och DhaB:s aktivitet minskade betydligt. Zhang et al. (2008) analyserade också robustheten vid grenpunkterna i glycerolupplösningsvägen. Det visades att fördelningen av kolflödet mellan den reduktiva och den oxidativa grenen var robust mot miljöförhållanden.

Effekt av luftning på 3-HP-produktion

Våra tidigare studier visade att mikro-aeroba förhållanden var gynnsamma för 3-HP-produktion. Jämfört med den anaeroba processen ökade 3-HP-produktionen i den mikro-aeroba fermentationen betydligt på grund av högre uttrycksnivå för aldehyddehydrogenas, och samtidigt minskade produktionen av 1,3-propandiol (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) rapporterade att den specifika aktiviteten hos glyceroldeshydratas i K. pneumoniae vid en luftningshastighet på 0,04 vvm var 59 % högre än vid avsaknad av lufttillförsel. Men det har rapporterats att glyceroldeshydratas snabbt kan inaktiveras av syre (Toraya 2000; Ruch och Lin 1975) och påverkade 3-HP-produktionen avsevärt (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Dessutom syntetiseras inte koenzym B12, kofaktorn för DhaB, i tillräcklig utsträckning under höga luftningsförhållanden i de flesta av de naturliga 3-HPA-producenterna, t.ex. K. pneumoniae. Huang et al. (2013) och Ko et al. (2017) visade också att hög aeroba förhållanden inte var fördelaktiga för 3-HP-produktion. Därför genomförde vi preliminära fed-batch-experiment under olika luftningsförhållanden och fann också att upprätthållandet av en hög luftningshastighet var ogynnsamt för 3-HP-produktionen efter det att celltillväxten upphörde (data visas inte). I fed-batchodling av JJQ02(pUC18-kan-aldH) antog vi en luftningshastighet som var hälften av den ursprungliga hastigheten när OD650 stängdes till det maximala värdet. Profilerna för tillväxt, glycerol och metaboliter visas i fig. 3, och den svarta pilen angav tidpunkten för att sänka luftningshastigheten (0,5 vvm).

Den slutliga titern av 3-HP nådde 61.9 g/L med ett utbyte på 0,58 mol/mol i 5-L-reaktorn på 38 timmar. 3-HP-koncentrationen och utbytet med JJQ02(pUC18-kan-aldH) var 3,3 och 2,76 gånger större än med Kp4 (pUC18-kan-aldH) och 1,28- och 2,07 gånger större än med JJQ01(pUC18-kan-aldH). Resultaten visade att produktionen av både 1,3-propandiol och 2,3-butandiol upphörde vid 20 timmar. Titerna av 3-HP fortsatte dock att öka även om produktionshastigheten minskade från denna tidpunkt. Under den senare delen av den mikro-aeroba fermentationen kunde en del NADH fortfarande regenereras via elektrontransportkedjan, även om lite NADH regenererades genom bildandet av 1,3-propandiol och 2,3-butandiol, eftersom det effektivaste sättet att regenerera NAD+ är via elektrontransportkedjan i närvaro av syre (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), vilket resulterade i en ökning av 3-HP utan uppenbar ökning av 1,3-propandiol och 2,3-butandiol.

300-L uppskalningsfermentering

För att undersöka genomförbarheten av stam JJQ02(pUC18-kan-aldH) för produktion av 3-HP i en större bioreaktor, utfördes fed-batch-fermentering i en 300-L-bioreaktor efter fermenteringsförhållandena som fastställts i 5-L-fermentorn. Tvåstegsbelysningsstrategi användes; belysningshastigheten sänktes till hälften vid tidpunkten för den svarta pilen enligt figur 4. 3-HP uppnådde 54,5 g/L med en avkastning på 0,43 mol/mol, och koncentrationen och avkastningen var 12,2 g/L och 0,11 mol/mol för 1,3-propandiol, 21,3 g/L och 0,11 mol/mol för 1,3-propandiol, 21,3 g/L och 0,11 mol/mol för 1,3-propandiol och 0,11 mol/mol för 1,3-propandiol.17 mol/mol för 2,3-butandiol och 9,3 g/L och 0,11 mol/mol för acetat på 51 timmar (fig. 4).

Jämfört med de resultat som erhölls i 5-L-reaktorn ökade titern och det molära utbytet av 2,3-butandiol i 300-L-reaktorn uppenbart, vilket liknade dem med samma stam i 5-L-reaktorn vid en konstant luftningshastighet på 1 vvm. Det innebar att syreöverföringen i 300-L-reaktorn kan vara något högre än i 5-L-reaktorn med minskad luftningshastighet eftersom vissa undersökningar har visat att produktion av 2,3-butandiol kräver lämplig luftningshastighet (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Under luftningsförhållandet i 300-L-reaktorn främjade uttrycket av de enzymer som är relaterade till 2,3-butandiolbildning och NADH-poolen eller NADH/NAD+-förhållandet produktionen av 2,3-butandiol, och uttrycket av DhaB och AldH kan påverkas något.

Med tanke på redoxbalansen, i ldhA dhaT dubbelmutantstammen, regenererades NADH som bildades i den reaktion som katalyseras av ALDH delvis genom bildning av 2,3-butandiol och andra reducerade metaboliter som etanol och succinat, och delvis genom elektrontransportkedjan (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Därför påverkade luftningshastigheten i mikroventilationsjäsningen slutprodukterna avsevärt. Vid fermentering i 300-litersreaktorn, även om luftningshastigheten minskades till hälften av den ursprungliga, kan syreöverföringssituationen fortfarande skilja sig mycket från den i 5-litersreaktorn på grund av de olika syreöverföringsegenskaperna, vilket var ett traditionellt ämne vid uppskalning av bioprocesser. Skillnaderna i produktfördelningen i de olika reaktorerna visade att det är viktigt att kontrollera syretillförseln noggrant, medan en enkel minskning av luftningshastigheten verkade vara alltför grov. Även om 3-HP-titern och avkastningen skiljde sig något från dem i 5-L-reaktorn var uppskalningen framgångsrik. Eftersom syreöverföringen i 300-litersreaktorn var annorlunda än i 5-litersreaktorn, förväntades det att ytterligare exakt reglering av luftningshastigheten i 300-litersreaktorn skulle kunna förbättra 3-HP-nivån.