En RNA-producerande DNA-hydrogel som plattform för ett högpresterande RNA-interferenssystem

Syntes och karakterisering av I-gel

De fyra oligonukleotiderna av X-DNA (X01-X04 DNA-strängar) syntetiserades kommersiellt av Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA). X-DNA-sekvenserna (kompletterande tabell 5) utformades, framställdes och karakteriserades genom att följa samma förfaranden som beskrivs i litteraturen med små ändringar10,13. Lyofiliserade DNA-strängar i 1 μmol skala samlades upp genom centrifugering vid 14 000 g i 15 s i rumstemperatur. Varje DNA-sträng resuspenderades till 1,0 mM koncentration i 1x TE-buffert (pH 8,0). Varje rör skakades och blandades med hjälp av MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, USA) vid 1500 rpm i ~3 timmar för att helt lösa upp de lyofiliserade oligonukleotiderna. Sammanlagt 0,05 μmol (50 μl) av varje DNA-sträng kombinerades i ett 1,5 ml-rör, och nukleasfritt vatten tillsattes så att den totala volymen av oligonukleotidblandningen uppgick till 500 μl. 100 μl av oligonukleotidblandningen fördelades i 0,5 ml-rör. Rören placerades i en termocyler (Bio-Rad, CA, USA). De fyra typerna av oligonukleotider (X01 ~04) annealerades under följande förhållanden: initial denaturering vid 95 °C i 10 minuter och 65 °C i 2 minuter, 60 °C i 5,5 minuter, sänkning med 1 °C med 1 minut vid denna temperatur, 20 °C i 30 sekunder och sänkning till 4 °C för stabilisering och lagring av X-DNA. För buffertbyte centrifugerades sedan den glödgade X-DNA-lösningen (500 μl) i en filterenhet (3 kDa Mw cutoff) för mikrocentrifugering i 6 timmar vid 15 000 g och 4 °C för att minska lösningsmedelsvolymen. Filterenheten överfördes till ett nytt centrifugeringsrör. Totalt 100 μl nukleasfritt vatten vid 4 °C tillsattes till filterenheten. Filterenheten centrifugerades i 4 timmar vid 15 000 g och 4 °C för att skölja X-DNA från återstående salter. Den avskurna filtermodulen ska placeras upp och ner i röret och centrifugeras vid 2 000 g i 3 min vid 4 °C. Tillsats av nukleasfritt vatten och centrifugering utfördes ytterligare två gånger med samma centrifugeringsrör för att fullständigt avlägsna resterande salt från X-DNA. Den slutliga volymen av X-DNA-lösningen kommer att vara ~300 μl. SiRNA-expressionsplasmid (I-plasmid) köptes och maximipreparerades av Cosmo Genetech (Seoul, Sydkorea). För att konstruera I-gelen linjäriserades I-plasmiderna med hjälp av restriktionsenzymet BamHI. Storleken på siRNA-genen var 66 bp med spacer (eller 498 bp med T7-promotorn) (se kompletterande figur 4 för I-plasmidens karta). Provernas DNA-mängder bestämdes utifrån deras UV/Vis-absorptionsvärde med hjälp av en BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). X-DNA och linjära plasmider blandades först i ett förutbestämt molförhållande i närvaro av T4 DNA-ligas (Promega, Madison, WI, USA) för att syntetisera Dgel. För ett förhållande X-DNA:I-plasmid på 1500:1 använde vi 10,5 μL av 75 μM X-DNA och 5,25 μL av 100 nM plasmid i en reaktionsvolym på 30 μL. För Blank-gel-experimentet ligerades samma mängd X-DNA-material som i I-gelen med T4 DNA-ligas. 10 µL av varje prov blandades med 2 µL gelbelastningsbuffert och elektroforeserades på en 0,7 eller 2 % agarosgel vid 100 V i 60 minuter. Alla DNA (X-DNA, I-plasmid, Blank-gel och I-gel) bekräftades genom agarosgelelektrofores (kompletterande figurer 3, 11 och 18). De syntetiserade D-gelerna avsaltades två gånger med hjälp av Amicon 3-kDa Mw cutoff mikrotubulära centrifugalfilter. För avbildning med svepelektronmikroskopi (SEM) frystorkades proverna i en FreeZone frystorkare (Labconco, Kansas City, MO, USA) tills allt vatten hade avlägsnats. De torkade proverna knäcktes för att avslöja deras färska ytor. Efter att ha sputterbelagts med ett 2~ 3-nm Pt-skikt under 100 s observerades morfologin hos dessa hydrogelytor vid ~50 000× förstoring med hjälp av ett S-3500N (Hitachi, Tokyo, Japan) svepelektronmikroskop vid en accelerationsspänning på 15 kV (kompletterande figur 19).

I-gelstabilitetstest

Sju prover framställdes för var och en av de fria I-plasmiderna och I-gelerna. I varje prov späddes 2 µl av den fria I-plasmidan (57 ng) eller I-gel (1:1500 gel innehållande 57 ng I-plasmid) i 12 µl destillerat vatten, därefter tillsattes 4 µl transkriberingsoptimerad 5 × buffert och behandlades med 3,33 × 10-5 enheter DNas I (nr M6101; Promega) till 20 µl slutvolym, följt av inkubation vid 37 °C i 0, 1, 4, 12, 24 och 48 timmar respektive. Efter inkubationen delades 20 µl-proverna upp i två alikvotar på 10 µl, en för elektrofores och en annan för efterföljande transkription. I varje alikvot avslutades denatureringsreaktionen genom tillsats av 1 µl RQ1 DNas-stopplösning och inkubation i 10 minuter vid 65 °C. Därefter blandades 10 µl av varje prov med 2 µl gelladdningsbuffert och elektroforeserades på en 2 % agarosgel vid 100 V i 60 minuter (kompletterande figur 13). En annan alikvot av varje prov användes för transkriberingsreaktion för att visa transkriptionseffektiviteten hos I-gel efter digestionsreaktionen. shRNA transkriberades från I-gel eller fria I-plasmidmallar (0, 24, 48 h) med hjälp av transkriptionskit (Riboprobe; Promega) enligt tillverkarens anvisningar. De erhållna shRNA:erna kvantifierades med RT-qPCR enligt beskrivningen i avsnitten Förberedelse av total-RNA och omvänd transkription och PCR i realtid och dataanalys (kompletterande tabell 4).

Expressions- och inhiberingsanalyser av proteiner

Kopplade transkriptions- och translations-kit (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, katalognummer 88882) köptes från Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), och reaktionerna utfördes genom att följa de förfaranden som föreslås av tillverkaren. I korthet blandades HeLa-celllysat, accessoriska proteiner, reaktionsblandning och pcDNA3.1( + ) IRES GFP-plasmid (0,5 μg/μL; nr 51406; Addgene, Cambridge, MA, USA) i en 12,5:2.5:5:5:2 (v/v) och inkuberades vid 30 °C i 1, 2, 4 och 6 h. Efter de angivna reaktionstiderna inkuberades provlösningarna i 24 h vid 4 °C för att både stoppa reaktionen och säkerställa tillräcklig proteinveckningstid. För att utvärdera störningseffektiviteten tillsattes fri I-plasmid eller I-gel till celllysatet i närvaro av 1000 ng GFP-plasmid. I kontrollexperimenten för det optimerade I-gel-tillståndet innehållande 57 ng I-plasmid (17,5 nmol), scrambled shRNA (17,5 nmol och 1,75 μmol; 1 ekv. respektive 100 ekv. i förhållande till mängden I-plasmid) (SN-1003; Bioneer, Seoul, Korea), scrambled plasmidblandning (17.5 nmol; scrambled shRNA-expressionsplasmidblandning; Cosmo Genetech), scrambled plasmidgel (scrambled plasmidblandning enzymatiskt tvärbunden med X-DNA), I-gelkomponenten (endast X-DNA, endast I-plasmid eller dessa blandningar utan enzymatisk tvärbindning, dvs. ingen gelbildning) eller Blank-gel (enzymatisk tvärbindning av endast X-DNA) tillsattes direkt till reaktionslösningen för GFP-expression. Alla reaktioner utfördes minst tre gånger. Om inget annat anges hölls reaktionsvolymen på 25 μL. Fluorescensspektren analyserades med hjälp av en spektrofluorofotometer (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seoul, Korea) för att bestämma nivån av GFP-uttryck i cellysatlösningen.

Total RNA-beredning och omvänd transkription

Som spike-in-kontroll tillsattes 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL; nr 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Kanada) till alla de föruttryckta celllysaten (20 µL) före RNA-extraktion. Därefter extraherades totalt RNA från 23 µL av lysatet med hjälp av TRIzol Reagent (Ambion, Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens anvisningar. Det extraherade totala RNA:t löstes upp i 10 µl DEPC-behandlat vatten (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Därefter polyadenylerades 2 µl totalt RNA med 1 mM ATP i 1 × poly(A)-polymerasbuffert innehållande 5 U Escherichia coli poly(A)-polymeras (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) vid 37 °C i 30 minuter i en 20 µl reaktionsblandning. För omvänd transkription blandades 4 µl av det svansade RNA:t med 1 pmol RT-primer och 0,5 mM dNTP-blandning och fylldes sedan på till en volym på 13 µl med DEPC-behandlat vatten. Blandningen värmdes vid 65 °C i 5 minuter och kyldes sedan snabbt på is. Reaktionsblandningen ökades sedan till en slutvolym på 20 µl genom tillsats av 5 mM dithiothreitol, 1 × buffert för första strängen, 40 U RNashämmare och 200 U SuperScript III omvänt transkriptas (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och inkuberades vid 50 °C i 1 timme, följt av enzyminaktivering vid 70 °C i 15 minuter. RT-primersekvenserna (se kompletterande tabell 5) utformades för syntesen av cDNA från RNA-sekvensen. Den primer som användes var 3′ RACE-adaptern, som tillhandahålls i FirstChoice RLM-RACE-kitet (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Alla primers syntetiserades av Cosmo Genetech, utom cel-miR-39 forward primer (Norgen Biotek Corp.). Återvinningsgraden av RNA i varje lysatlösning uppskattades utifrån skillnaden mellan CT-värdet för den erhållna spike-in-kontrollen och referens cel-miR-39 (som inte fortsatte med extraktionsprocessen).

Realtids-PCR och dataanalys

Mängderna shRNA och GFP mRNA kvantifierades genom qPCR med hjälp av StepOne Real-Time PCR-systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qPCR för varje prov utfördes i en total volym på 20 µl med 2 µl cDNA, 10 µl av 2 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) och 10 pmol av varje primer. Amplifieringen utfördes under följande förhållanden: inledande denaturering vid 95 °C i 10 minuter och 30 cykler vid 95 °C i 15 s, 60 °C i 30 s och 72 °C i 30 s. qPCR utfördes också med cel-miR-39 som referens-RNA för att erhålla återvinningsgraden av totalt RNA i varje prov. Protokollet för qPCR var detsamma som det som beskrivs ovan i detta avsnitt, med undantag för de primers som användes, som var 10 pmol av en gemensam omvänd primer (samma som den omvända primern för shRNA) och cel-miR-39 framåtprimer. Smältkurvan för varje amplifierad DNA-produkt erhölls genom att mäta fluorescensintensitetsförändringen hos SYBR Green-färgämnet sex gånger per prov samtidigt som temperaturen ökades från 60 °C till 95 °C med en hastighet av + 0,3 °C/s efter avslutad qPCR. De specifika primrarna för qPCR utformades med hjälp av programmet Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (kompletterande tabell 5). Det relativa uttrycket av målen bestämdes med hjälp av den komparativa 2-ΔΔΔCT-metoden. Den relativa mängden GFP mRNA bekräftades också genom mätning av bandintensiteten på 2 % agarosgelen. Amplifiering av cDNA utfördes med samma PCR-förhållanden och program som användes för qPCR som beskrivs ovan, med undantag för PCR-cykelantalet (20 för GFP mRNA).

Kalibrering och kvantifiering av den absoluta RNA-mängden

Standardkurvor för RNA-koncentrationen och CT-värdet erhölls genom att använda varje RNA-standardmaterial. För shRNA erhölls standardkurvan genom att använda syntetiserade shRNAs som köpts från Integrated DNA Technologies. För GFP mRNA erhölls kurvan med hjälp av GFP mRNA som extraherats från ett transkriptionskit (Riboprobe; Promega) enligt tillverkarens anvisningar. RNA-mängden för standard shRNA informerades av Integrated DNA Technologies, medan den för det extraherade standard GFP mRNA bestämdes utifrån dess UV/Vis-absorptionsvärde med hjälp av BioSpectrometer. Det erhållna standard-RNA:t omvandlades till cDNA genom omvänd transkription enligt beskrivningen ovan i avsnittet ”Beredning av totalt RNA och omvänd transkription”. Därefter späddes cDNA:et 10, 100, 1000 och 10 000 gånger och qPCR upprepades tre gånger, och de erhållna CT-värdena användes för att erhålla en standardkurva. De CT-värden som erhölls från RT-qPCR konverterades till de ursprungliga RNA-koncentrationerna i celllysaten genom en kalibreringsprocess (kompletterande figur 6). Den slutliga absoluta mängden RNA bestämdes genom att multiplicera varje RNA-återvinningsgrad (%) och värdet av RNA-mängden från kalibreringskurvan (kompletterande tabeller 1, 2).

Cellulär märkning med Cy5-I-gel

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler erhölls från Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea) och förvarades i DMEM kompletterat med 10 % serum från fetalt nötkreatur och 1 % penicillin-streptomycin i en fuktad och CO2 (5 %)-hållen inkubator. MDCK-celler som uttrycker GFP (MDCK-GFP) framställdes genom att transfektera pEGFP-N1-vektorn i cellerna med hjälp av Lipofectamine-reagens (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens protokoll. Därefter sorterade vi de GFP-emitterande cellerna med hjälp av FACSCanto II-systemet (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Under hela undersökningen testades cellerna negativt för mykoplasmakontaminering. Odlade MDCK-GFP-celler i 24-brunnsplattor med täckglas (50 000 celler per varje brunn) sammanföll med Cy5-I-gel (Cy5-konjugerad I-gel) som innehöll Cy5-konjugerade X01-dna-sekvenssträngar (motsvarande 2,625 μM X-DNA; Integrated DNA Technologies) i serumfritt medium i 4 timmar. För att bereda Cy5-I-plasmidan framställdes först Cy5-dsDNA (Cy5-konjugerat dsDNA) genom annealing av Cy5-konjugerat X01 (med en extra 5′-p-GATC klibbig ände) och dess komplementära motsträng (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Därefter blandades Cy5-dsDNA och I-plasmid och ligerades i molförhållandet 5 000:1. Överflödigt obundet Cy5-dsDNA avlägsnades genom centrifugering (12 400 g, 4 °C, 60 minuter) med Amicon mikrotubulära centrifugalfilter (50 kDa Mw cutoff) 4-5 gånger. Cy5-shRNA (Cy5-konjugerat shRNA) syntetiserades kommersiellt (Integrated DNA Technologies). För Cy5-I-plasmid- och Cy5-shRNA-uppsättningarna samköptes cellerna med 2,625 nM av varje prov i serumfritt medium i 4 timmar. För Lipofectamine-Cy5-I-plasmid- och Lipofectamine-Cy5-shRNA-uppsättningarna komplexerades Lipofectaminet och det Cy5-konjugerade provet elektrostatiskt genom att de blandades i ett molförhållande 1:1 till en slutkoncentration i lösningen på 2,625 μM Lipofectamin och 2,625 μM substrat. Därefter samkonducerades cellerna med 2,625 μM Lipofectamine-Cy5-I-plasmid eller Lipofectamine-Cy5-shRNA i serumfritt medium i 4 timmar respektive. När det gäller cellkontrollen samköptes cellerna med serumfritt DMEM innehållande 1 % (v/v) penicillin (HyClone). Efter 4 h samkubation tvättades alla prover två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-buffert (0,1 M, pH 7,4) och cellerna inkuberades ytterligare i 6 h i ett tillväxtmedium som innehöll 10 % (v/v) fetalt bovint serum (FBS; HyClone) och 1 % penicillin för att säkerställa tillräcklig cellulär återhämtning och upptagningstid. De odlade cellerna fixerades med 4 % formaldehyd i 10 minuter i rumstemperatur och tvättades ytterligare tre gånger med PBS-buffert (0,1 M, pH 7,4). För mikroskopisk avbildning monterades täckglas med de fastsatta cellerna på glasobjektsglas med hjälp av ett vattenhaltigt monteringsmedium med ett antifadingsmedel. Fluorescensbilderna registrerades med ett Zeiss Axioplan 2-mikroskop och bilderna togs med en Zeiss Axiocam HR-kamera.

GFP-gen-silencing-experiment med hjälp av I-gel

Först inkuberades I-gelen som innehöll 262,5 µM X-DNA och 175 nM I-plasmid med 300 U T7 RNA-polymeras (Thermo Fisher Scientific) i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter inkuberingen späddes I-gelprovet till 100 gånger i serumfri DMEM innehållande 1 % penicillin. Därefter tillsattes 1/6 gånger volymen av I-gel/polymeraskomplexet till varje brunn i en 24-brunnsplatta med täckglas som hade preplaterats med MDCK-GFP-celler (20 000 celler per brunn) under 24 timmar. För I-plasmid, scrambled plasmidblandning och scrambled plasmid-geluppsättningar samodlades MDCK-GFP-celler med samma molära mängd av varje plasmid och T7 RNA-polymeras som i fallet med I-gel. För att mäta RNAi-effekten av naket shRNA och Lipofectamin-shRNA användes 100 gånger mer av varje RNA-prov i förhållande till antalet I-plasmidmall, med hänsyn till shRNA-uttrycksfrekvensen i I-gelen som beräknad från celllysatförsöket. För de nakna shRNA- och scrambled shRNA-uppsättningarna samköptes MDCK-GFP-celler med 175 nM av RNA-provet. De Lipofectamin-komplexerade proverna framställdes enligt tillverkarens anvisningar. För Lipofectamine-I-plasmid och Lipofectamine-scrambled plasmid mixture sets komplexerades Lipofectamine och varje plasmidprov elektrostatiskt genom att blanda dem i ett molförhållande på 5:1 för att erhålla en slutlig lösningskoncentration på 8,75 nM Lipofectamine och 1,75 nM plasmidsubstrat. För Lipofectamine-shRNA-uppsättningen komplexerades Lipofectamine och fritt shRNA elektrostatiskt genom att blanda dem i ett molförhållande på 5:1 för att erhålla en slutlig lösningskoncentration på 875 nM Lipofectamine och 175 nM shRNA. MDCK-GFP-cellerna samkuberades med de så förberedda Lipofectamin-komplexerade proverna i serumfritt medium i 4 timmar. För den enda celluppsättningen inkuberades endast MDCK-GFP-cellerna i det serumfria mediet i 4 timmar, utan några prover. Alla prover tvättades ut efter den 4 timmar långa samkubationsperioden, och cellerna inkuberades dessutom i 48 timmar med tillväxtmedium (DMEM innehållande 10 % (v/s) FBS och 1 % penicillin) för att utvärdera RNA-silenceringseffekten vid 37 °C under 5 % CO2. Cellerna fixerades sedan med 4 % formaldehyd i 10 minuter i rumstemperatur och tvättades med PBS-buffert (0,1 M, pH 7,4). För bildframställning i mikroskop monterades de täcklockfästa cellerna på glasobjektsglas med hjälp av vattenhaltigt monteringsmedium med ett antifadingmedel.

Genuttrycksanalys genom kvantitativ PCR i levande celler

Alla prover behandlades till och inkuberades i varje cellmedium i samma mängd och under samma förhållanden som användes i det tidigare beskrivna GFP-gen-sileringsexperimentet med hjälp av I-gel-sektionen. Efter inkubationen sögs cellmediet upp från cellodlingsplattorna, och MDCK-GFP-cellerna tvättades en gång med PBS-buffert och trypsiniserades för att lossa cellerna i varje brunn i plattan. De lossnade cellerna späddes med PBS-buffert för att inaktivera trypsinet och samlades sedan upp i ett 1,5 ml mikrorör och pelleterades genom centrifugering (180 g, 5 min). Supernatanten avlägsnades och cellerna späddes med 20 µl PBS-buffert. Cellsuspensionslösningen (20 µL) behandlades med 1 mL TRIzol-reagens, 3 µL cel-miR-39 (33 fmol/µL) och 200 µL kloroformlösning. Den efterföljande RNA-extraktionen utfördes enligt tillverkarens anvisningar. För att kvantifiera den relativa mängden GFP mRNA och shRNA på cellnivå utfördes alla qPCR:er av provpreparaten enligt samma metod som beskrivs i avsnitten ”Beredning av totalt RNA och omvänd transkription” och ”PCR i realtid och dataanalys”.

Cellbildsanalys för kvantifiering av pixelintensitet

För att bearbeta cellbilden utfördes data med hjälp av programmet MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). De råa fluorescensbilderna importerades till MATLAB och varje pixel i bilderna konverterades till varje komponent i matrisen. Fördelningen av fluorescensintensiteterna för varje komponent representerades grafiskt av ett histogram. Hela datasetet delades in i 256 intervaller.

Fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys

Cellerna tvättades en gång med 1 mL PBS följt av att tillväxtmediet sögs upp från cellodlingsplattorna. Därefter lossades cellerna från plattan genom trypsinbehandling. De lossnade cellerna samlades upp i ett 15-mL-rör följt av centrifugering som resulterade i en pellet (180 g, 3 min). Den supernatanta trypsinlösningen avlägsnades och cellpelleten tvättades två gånger med 2 mL PBS. Cellerna återuppsattes i PBS till en koncentration på 50 000 celler/mL. Därefter preparerades proverna genom att cellerna fixerades i 1 % formaldehydlösning i 10 minuter i rumstemperatur. Proverna analyserades för GFP-fluorescensintensitet med hjälp av FACSCanto II-systemet (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Relativa livsduglighetsnivåer i mörkt tillstånd

En MDCK-GFP-cellsuspension (5 000 celler per brunn) fördelades i en 96-brunnsplatta (Corning Inc., Corning, NY, USA) och inkuberades i ett dygn vid 37 °C under 5 % CO2. När cellerna hade fäst sig på plattan samlokaliserades de med olika koncentrationer av I-gel (motsvarande X-DNA-koncentrationen) i tillväxtmediet (DMEM innehållande 10 % (v/v) FBS och 1 % penicillin) i mörker. I-gelen bestod av ett molförhållande X-DNA:I-plasmid på 1500:1. Dessa prover inkuberades i 6, 24 och 48 timmar vid 37 °C under 5 % CO2. I slutet av varje inkubationstid tillsattes Cell Counting Kit-8-lösning (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) till proverna enligt tillverkarens anvisningar. Efter ytterligare inkubation i 1 timme mättes absorbansen vid 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Resultaten av denna mätning uttrycktes som kvoten mellan provets absorbans och absorbansen hos de negativa kontrollcellerna utan provinkubation.

Statistisk analys

Den statistiska analysen utfördes med programvaran Prism 7.05 (GraphPad Software) för Student’s t-test, envägs ANOVA med Bonferroni posttest för flera jämförelser. Holm-Bonferroni-posttestet för multipla jämförelser utfördes med hjälp av resultat från Bonferroni-posttestet för multipla jämförelser från programvaran Prism 7.05 (GraphPad Software)30. Normalitetstestet beräknades med hjälp av Shapiro-Wilk-testet. I resultaten av Shapiro-Wilk-testet var data ungefär normalt fördelade. Statistisk signifikans anges som *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.