Förhöjda plasmanivåer av 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) hos patienter med pseudoexfoliationsglaukom

Abstract

Syfte. För att undersöka systemisk oxidativ stress-inducerad DNA-skada hos patienter med pseudoexfoliationsglaukom (PXG) uppskattade vi plasmanivåerna av 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) som en markör för oxidativ DNA-skada i jämförelse med kontroller. Dessutom undersökte vi också en kombinerad effekt av lysyloxidas-liknande 1 (LOXL1)-polymorfismstatus och 8-OHdG-nivåer på PXG-risken. Material och metoder. En retrospektiv fall-kontrollstudie genomfördes för att uppskatta plasmanivåerna av 8-OHdG hos 41 PXG-patienter och 45 icke-laukomatösa kontroller med hjälp av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Testet utfördes i två exemplar på en automatiserad ELISA-analysator. Två vanliga polymorfismer (rs1048661 och rs3835942) i LOXL1-genen genotypades genom Sanger-sekvensering. Resultat. Medel- och mediannivåerna av 8-OHdG var signifikant förhöjda i PXG-fallen () och de manliga försökspersonerna (). Försökspersoner med nivåer över den tredje kvartilen (75 % percentil) uppvisade en signifikant ökad risk för PXG (oddskvot = 4,06, 95 % konfidensintervall (CI = 1,11-14,80, )). Jämförelser inom och mellan grupper visade att medelnivåerna var högre hos individer som bar riskvarianten LOXL1 (G/G), men inte statistiskt signifikant. I logistisk regressionsanalys visade både 8-OHdG () och rs3835942 () en statistiskt signifikant effekt på PXG-resultatet. Effekten försvann dock när ålder, kön och rs1048661 inkluderades. En signifikant positiv korrelation observerades mellan 8-OHdG-nivåer och intraokulärt tryck (, ) och cup/disc ratio (, ). Dessutom var arean under kurvan statistiskt signifikant vid analys av mottagaroperativ karakteristik () med ett värde på 0,635 (95 % KI = 0,518-0,751). Slutsats. Studien visar ett samband med ökade plasmanivåer av 8-OHdG hos patienter med PXG, vilket stöder den roll som oxidativ stress och ökad oxidativ DNA-skada spelar vid utveckling av PXG.

1. Introduktion

Glaukom är en av de främsta orsakerna till irreversibel blindhet i världen , inklusive i Saudiarabien . Som ett resultat av blockerat utflöde av kammarvattenhumör vid trabekelverket (TM) anses förhöjt intraokulärt tryck (IOP) vara en primär riskfaktor som utlöser död av retinala ganglieceller (RGC) och progressiv förlust av RGC-axoner, vilket orsakar glaukomatös optisk neuropati . Pseudoexfoliationsglaukom (PXG) kännetecknas ofta av ackumulering av onormala fibrillära extraceullulära material i ögats främre segment, främst längs pupillgränsen, vilket anses vara ett patologiskt kännetecken för sjukdomen . I jämförelse med det vanligare primära öppenvinkelglaukomet (POAG) uppvisar patienter med PXG ofta ett mer aggressivt kliniskt förlopp med högre IOP, större cupping, allvarliga synfältsdefekter och sämre prognos med snabb utveckling av sjukdomen . Det saknas systematiska epidemiologiska studier i litteraturen för att veta den exakta prevalensen av PXG i Saudiarabien. Det har dock observerats att av cirka 600 nya glaukomfall som registrerats vid vår glaukomenhet vid King Abdulaziz University Hospital i Riyadh, diagnostiseras mindre än 10 % av dessa fall med PXG.

PXG representerar en komplex och multifaktoriell sjukdom som uppkommer hos vuxna. Sjukdomen innefattar både genetiska och miljömässiga faktorer som bidrar till sjukdomens etiologiska patofysiologi . Lysyloxidas-liknande 1 (LOXL1) är en stark kandidatgen som rapporterats bidra till risken för utveckling av PXG i flera etniska grupper, inklusive saudiaraber. LOXL1 är involverad i bildandet och stabiliteten av extracellulär matris . Det finns starka bevis som tyder på att oxidativ stressmekanism(er) spelar en roll i patogenesen för PXG . Oxidativ stress induceras i allmänhet genom bildning av reaktiva syrearter (ROS) såsom superoxid, peroxid och hydroxylradikaler som kan initiera och sprida fria radikaler . Ackumulering av ROS-nivåer i cellerna inducerar oxidativ skada i makromolekyler som lipider, proteiner, RNA, DNA och mitokondrier, vilket resulterar i cellulär dysfunktion och/eller apoptos . Det har visats att oxidativ stress orsakar en ökning av IOP genom att inleda TM-degeneration, vilket hindrar vattenutflödet . Mutationer, haplogrupper och minskad andningsaktivitet i mitokondrierna har också förknippats med olika typer av glaukom . Dessutom har en polymorfism i genen för glutation S-transferas (GST), ett enzym som är involverat i avgiftningen av peroxiderade lipider och olika skadliga toxiner, också förknippats med glaukom . Minskad GST-aktivitet kan störa avgiftningen av oxidativa metaboliter och förvärra de skadliga effekterna av oxidativ stress på synnerven . Den totala antioxidantstatusen (TAS) i biologiska prover är en viktig indikator på oxidativ stress och ett användbart verktyg för att förutsäga oxidativ status . Vår tidigare studie har visat att plasmanivåerna av TAS var signifikant låga hos PXG-patienter jämfört med kontroller, vilket stöder den oxidativa stressens roll i patogenesen av PXG . Dessutom rapporterade vi också en kombinerad effekt av LOXL1-allelerna och den minskade TAS som kan bidra till den totala risken för PXG. Hos människor har in vivo-experiment visat att oxidativa DNA-skador är betydligt rikligare i TM-cellerna hos glaukompatienter. Dessutom var både ökat IOP och synfältsskador signifikant relaterade till mängden oxidativa DNA-skador som påverkar TM-cellerna . Oxidativ stress/ROS kan orsaka brott eller basmodifieringar i DNA vilket leder till att DNA-oxidationsprodukter frigörs, bland annat 8-hydroxy-2′-deoxyguanosin (8-OHdG) . 8-OHdG är en av de många produkter av DNA-oxidation som lätt kan kvantifieras och används vanligen som en biomarkör för att bedöma oxidativ DNA-skada .

Syftet med den här studien var att undersöka systemisk oxidativ stress-inducerad DNA-skada hos patienter med PXG. Vi uppskattade plasmanivåerna av 8-OHdG som en markör för oxidativ DNA-skada och jämförde dem med icke-glaukomatösa friska kontroller. Dessutom undersökte vi också den kombinerade effekten av LOXL1-polymorfismstatus och 8-OHdG-nivån på risken för PXG.

2. Material och metoder

2.1. Studiepopulation

Studien följde principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av den institutionella granskningsnämnden och forskningsetiska kommittén (godkännandenummer # 08-657). Efter skriftligt informerat samtycke rekryterades deltagare av saudiarabiskt ursprung med fastställd klinisk diagnos av PXG () och etniskt matchade friska kontroller () för studien vid King Abdulaziz University Hospital i Riyadh, Saudiarabien. Inklusions- och exklusionskriterierna för patienter och kontroller har beskrivits tidigare .

2.2. Plasma- och DNA-preparering

Plasmaprover erhölls från EDTA-blod efter centrifugering vid 5500 ×g i 5 minuter. DNA extraherades från buffy layer med hjälp av illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Förvaringen skedde vid -80 °C fram till användning.

2.3. Uppskattning av plasmanivåer av 8-hydroxy 2′-Deoxyguanosin

Uppskattningen av 8-OHdG-nivåerna utfördes med hjälp av ett kommersiellt kit (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) baserat på en kompetitiv sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Testet utfördes i två exemplar på en ChemWell-T automatiserad ELISA-analysator (Awareness Technology Inc., FL, USA) enligt tillverkarens anvisningar. 8-OHdG-nivåerna fastställdes med hjälp av standardkurvan och uttrycktes i ng/mL.

2,4. LOXL1 Sanger-sekvensering

DNA-prover sekvenserades för de två vanliga polymorfismerna i LOXL1-genen (rs1048661 och rs3825942) med hjälp av primers och amplifieringsbetingelser som beskrivs på andra ställen.

2.5. Statistisk analys

Data presenteras som medelvärde ± SD och median för kontinuerliga variabler och som antal och procentandelar för kategoriska variabler. Testning av normalitet för 8-OHdG-nivåer gjordes med hjälp av Kolmogorov-Smirnov-testet. Medelskillnader mellan grupper testades med hjälp av Students t-test. Mann-Whitney U-testet användes för att jämföra medianvärden mellan patienter och kontroller. De kategoriska variablerna testades i förekommande fall med chi-två-testet och Fishers exakta test. Korrelationstesterna gjordes med hjälp av Pearsons metod. En binär logistisk regressionsanalys utfördes för att uppskatta inverkan och effekten av genomsnittliga 8-OHdG-nivåer och andra riskfaktorer på sjukdomsutfallet. En ROC-kurva (receiver operating characteristic) genererades och AUC-värdet (area under the curve) analyserades med Mann-Whitney-testet. Odds ratio (OR) beräknades och ett konfidensintervall (CI) sattes till 95 %. Alla statistiska tester var tvåsidiga, och ett värde mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Statistisk analys utfördes med SPSS version 19.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA) och programvaran StatView version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).

3. Resultat

3.1. Studiepopulation och 8-OHdG-nivåer

Som framgår av tabell 1 fanns det ingen signifikant skillnad mellan PXG-fall och kontroller när det gäller ålder, kön, systemisk sjukdomsstatus, rökning och familjehistoria av glaukom. Normalitetstester för 8-OHdG-nivåer visade en skev fördelning (). Både medel- och mediannivåerna av 8-OHdG var signifikant förhöjda hos PXG-fallen och de manliga försökspersonerna jämfört med kontrollerna (tabell 1). Figurerna 1(a) och 1(b) visar boxplotrepresentationen av 8-OHdG-nivåerna enligt sjukdomsstatus respektive könsfördelning.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Nivåer av 8-OHdG och risk för PXG

För att bedöma risken för PXG i samband med ökande nivåer av 8-OHdG dikotomiserades 8-OHdG-koncentrationerna (ej kategoriserade som fall och kontroller) vid den 50:e percentilen (eller medianvärdet) och per kvartil (tabell 2). Det övergripande medianvärdet för 8-OHdG-nivån var 17,68 ng/mL. Även om fallen uppvisade en ökad risk för sjukdom vid denna nivå (OR = 1,76, 95 % CI = 0,75-4,15) var skillnaden inte signifikant (). På samma sätt, med hjälp av kvartilfördelning, identifierades två gränsnivåer som var 10,08 ng/mL (första kvartilen eller 25:e percentilen) och 27,72 ng/mL (tredje kvartilen eller 75:e percentilen). Med hjälp av dessa två gränsvärden kategoriserades försökspersonerna sedan i tre grupper: mindre än den första kvartilen, interkvartilen och större än den tredje kvartilen (tabell 2). Sammantaget fanns det ingen signifikant additiv effekt av ökande nivåer av 8-OHdG och PXG-resultat (χ2 = 4,87, df = 2; ). Jämfört med 8-OHdG-nivåer som var lägre än den första kvartilen (<10,08 ng/mL) uppvisade dessutom försökspersoner med interkvartilnivåer en icke-signifikant ökad risk för sjukdom (OR = 2,50, 95 % CI = 0,81-7.63, ), medan försökspersoner med nivåer över den tredje kvartilen (75:e percentilen) uppvisade en signifikant ökad risk för PXG (OR = 4,06, 95 % CI = 1.11-14,80, ).

3.3. 8-OHdG-nivåer och LOXL1-polymorfismer

Vi undersökte vidare genotypeffekten av polymorfismerna rs1048661 (g.5758 G>T) och rs3825942 (g.5758 G>A) i LOXL1-genen på 8-OHdG-nivåer i PXG-fall och kontroller. Sammantaget fanns det, som framgår av tabell 3, ingen signifikant skillnad mellan 8-OHdG-nivåer och olika genotyper för båda LOXL1-polymorfismerna (figurerna 1(c) och 1(d)).

För rs1048661 var G/G den vanligaste genotypen, följt av G/T och T/T. Ingen T/T homozygositet observerades i patientgruppen jämfört med endast en i kontrollerna. De genomsnittliga 8-OHdG-nivåerna observerades vara högst i G/G-genotyperna jämfört med G/T-, T/T- eller G/T + T/T-grupperna. Dessa nivåer varierade dock inte signifikant både inom och mellan jämförelserna mellan undersökningsgrupperna.

Samma sak gäller för rs383592, G/G var den vanligaste genotypen, följt av G/A- och A/A-genotyperna, där den sistnämnda inte förekom hos PXG-patienterna. G/G var den vanligaste genotypen som uppvisade de högsta nivåerna av 8-OHdG i jämförelse med G/A-, A/A- eller G/A + A/A-grupperna. Nivåerna varierade inte signifikant mellan fall och kontroller för G/G-genotyperna (). Dessutom visade en jämförelse inom grupperna i kontrollerna inte heller någon signifikant genotypeffekt på 8-OHdG för G/A (), A/A, () och G/A + A/A () jämfört med G/G-genotypen.

3.4. 8-OHdG-nivåer och andra riskfaktorer

För att undersöka effekten av ålder, kön, LOXL1-polymorfismer och 8-OHdG-nivåer hos patienter med PXG utfördes en binär logistisk regressionsanalys med sjuka/icke-sjuka som beroende variabel (utfall). Analysen visade att både 8-OHdG () och rs3835942 () har statistiskt signifikant effekt på sjukdomsutfallet. I en kombinerad analys med ålder, kön, 8-OHdG, rs1048661 och rs3835942 visade dock ingen av dessa riskfaktorer någon signifikant inverkan på PXG (tabell 4).

3.5. Korrelation mellan 8-OHdG och andra glaukomindex hos PXG-patienter

En signifikant positiv korrelation observerades mellan 8-OHdG och IOP (, ) och cup/disc ratio (, ), till skillnad från ingen med ålder (, ) och antal antiglaukomläkemedel (, ).

3.6. ROC-kurva och 8-OHdG

ROC-kurvanalys av 8-OHdG-nivåerna hos PXG-patienter och kontroller avslöjade en AUC på 0,635 (95 % KI = 0,518-0,751) som var statistiskt signifikant (), vilket tyder på att plasmanivåerna av 8-OHdG på ett tillfredsställande sätt kunde skilja mellan PXG-patienter och kontroller.

4. Diskussion

Ökat ROS, oxidativ skada och obalans mellan prooxidantstatus och antioxidantstatus är kritiska faktorer som väsentligt bidrar till glaukomatös neurodegeneration . Denna studie rapporterar ökade nivåer av systemisk 8-OHdG, en markör för oxidativ stress-inducerad DNA-skada, hos patienter med PXG.

DNA-skada kan tillfogas av både extrinsiska och intrinsikala agens såsom joniserande strålning, ultraviolett ljus, giftiga kemikalier/metalljoner och ROS som genereras som en följd av normal cellulär syremetabolism . De endogena processer som rimligen kan bidra till en pågående DNA-skada in vivo omfattar oxidativ metylering, depurinering och deaminering . ROS-inducerade skador omfattar bas- och sockerskador, protein- och DNA-korslänkar samt enkelsträngs- och dubbelsträngsbrott. Dessutom är basen guanin mest mottaglig för oxidativa modifieringar på grund av sin lägsta redoxpotential . Den vanligaste biprodukten som bildas på grund av oxidativ modifiering av guanin med hydroxylradikal är 8-hydroxyguanin (8-OH-Gua) och dess 2′-deoxynukleosidekvivalent, 8-OHdG, som föreslås vara en utmärkt markör för oxidativ skada på DNA . Ett antal studier har gett starka bevis för ett samband mellan ökade nivåer av 8-OHdG och glaukomatös optisk neuropati .

Initiala studier på mänskliga TM-prover som erhållits under filtreringskirurgi har visat att det finns höga nivåer av 8-OHdG hos patienter med glaukom . I en studie av Sorkhabi et al. som omfattade 15 POAG- och 13 PXG-patienter var både 8-OHdG-nivåerna i kammarvattnet (AH) och i serum höga hos patienterna jämfört med kontrollerna . På samma sätt har höga serumnivåer av 8-OHdG rapporterats hos patienter med primärt vinkelslutningsglaukom jämfört med normala personer . Yuki och Tsubota rapporterade att en ökad nivå av 8-OHdG/kreatinin i urinen var förknippad med glaukomatös synfältsutveckling hos personer med normalspänningsglaukom . I en annan nyligen genomförd studie av Mohanty et al. var både plasma- och AH 8-OHdG-nivåerna betydligt högre hos POAG-patienter jämfört med kataraktkontroller . Denna effekt tillskrevs ett minskat uttryck av DNA-reparationsenzymer i basexcisionsreparationsvägen . I studien rapporterades dessutom en stark positiv korrelation mellan systemiska (plasma) 8-OHdG-nivåer och AH 8-OHdG-nivåer, vilket tyder på att systemiska 8-OHdG-nivåer skulle kunna förutsäga lokala 8-OHdG-nivåer i ögat .

Den exakta rollen av 8-OHdG och/eller oxidativ stress som leder till utveckling och progression av glaukomatös optisk neuropati är fortfarande spekulativ. 8-OHdG är en av de bäst karakteriserade oxidativa skadorna och kan ge upphov till mutationer från C : G till A : T-transversioner . Vissa skador i DNA utsätts för cellulär reparation genom DNA-reparationsmekanismer in vivo som klyver det skadade DNA:t . Om dessa skador inte repareras kan de dock få allvarliga biologiska konsekvenser och leda till cancerogenes eller utveckling av neurodegenerativa sjukdomar . 8-OHdG kan också avsevärt inducera telomerförkortning som kan bidra till fysiologiska och patologiska tillstånd in vivo . Dessutom har det föreslagits att 8-OHdG kan ha en epigenetisk liknande reglerande roll i celler som utsätts för oxidativ stress när det gäller reglering av gentranskription . De onormala effekterna av oxidativ stress och ROS i glaukomets patogenes genom ökat IOP och/eller hypoxi, TM-degeneration, gliacellskador, autofagi, mtDNA-skador, aktivering av nuclear-kappa B, peroxynitritstress och okulär hemodynamik som stimulerar apoptos och inflammatoriska vägar för att främja död av RGC:er och skador på synnerven har dessutom dokumenterats väl . Ökade nivåer av 8-OHdG som observerades i vår studie kan sannolikt bidra till PXG-patogenesen genom liknande mekanismer.

Ett starkt samband mellan två missense-varianter, rs1048661 och rs3825942, i LOXL1-genen och PXG har konsekvent replikerats i flera etniska grupper, inklusive saudiaraber . En fullständig förståelse av detta genetiska samband med PXG-patologi är fortfarande inte känd; ett antal mekanismer har dock postulerats. Dessa inkluderar dess effekt på elastinbildningen, förändrat LOXL1-uttryck, splicing-effekt eller möjligheten att de är associerade/kopplade till en faktisk oidentifierad funktionell allel . Vi undersökte genotypeffekterna av dessa två vanliga varianter på 8-OHdG och deras kombinerade effekt på risken för PXG. Genotyperna visade sig inte påverka 8-OHdG-nivåerna, även om nivåerna var höga i riskvarianterna (G/G). Både 8-OHdG och rs3835942 befanns vara betydande riskfaktorer för PXG. Denna signifikans försvann dock i en kombinerad analys som även inkluderade ålder, kön och rs1048861-genotyper. En brist på tillräckligt antal i varje genotypgrupp kan vara en trolig förklaring till denna förlust och avsaknad av någon signifikant effekt.

Ett ökat IOP och synfältsskador har varit signifikant korrelerat med mängden oxidativa DNA-skador i TM-cellerna . På samma sätt visade IOP och cup/disc-förhållandet också en signifikant positiv korrelation med 8-OHdG-nivåerna i vår studie, vilket tyder på dess möjliga användbarhet som en markör för sjukdomens svårighetsgrad. Dessutom har ett antal rapporter visat att det finns ett omvänt förhållande mellan antioxidativa försvarsmekanismer och oxidativ stress i patofysiologin vid glaukom . Vår grupp har också tidigare rapporterat en signifikant minskad total antioxidantstatus (TAS) i plasma hos PXG-patienter jämfört med kontroller . Intressant nog fanns TAS-nivåer tillgängliga för PXG-patienterna (inte för kontrollerna; data visas inte) som ingick i denna studie som visade en signifikant negativ korrelation mellan 8-OHdG och TAS hos PXG-patienter (, ), vilket stödjer den plausibla rollen av ökad oxidativ stress och minskade antioxidativa försvarsmekanismer i PXG.

Fynden i denna studie kräver försiktig tolkning på grund av dess vissa begränsningar. För det första måste vi erkänna att den systemiska ökningen av 8-OHdG kanske inte exakt återspeglar situationen i ögats främre kammare, där celler/vävnader ständigt utsätts för en högre mängd angrepp av fria radikaler och därmed är mer direkt involverade i utvecklingen och progressionen av glaukom genom mekanismerna för oxidativ stress. Detta skulle kräva ytterligare validering i prover från AH. För det andra är studien rent deskriptiv till sin natur och ger inga tidsmässiga eller mekanistiska bevis eller föreslår några kausala implikationer av förhöjt 8-OHdG i PXG. Slutligen har ett relativt litet antal prover undersökts i denna studie. En replikering i en mycket större kohort skulle säkerligen stärka observationerna i denna studie. Med tanke på en genomsnittlig skillnad (effektstorlek) på 13 ng/mL i 8-OHdG-koncentrationen som observerats mellan PXG-fall och kontroller, med en genomsnittlig standardavvikelse på 20 och ett typ I-fel på 0,05 (dubbelsidigt), uppvisar studien ändå en effekt på >80 %.

5. Slutsats

För att sammanfatta visar studien en ökad nivå av systemisk 8-OHdG hos patienter med PXG, vilket stödjer ett samband mellan denna markör och PXG, och den plausibla rollen av oxidativ stress och ökad oxidativ DNA-skada i PXG-etiologin.

Datatillgänglighet

Den data som stödjer slutsatserna i denna artikel presenteras alla i artikeln.

Etiskt godkännande

Studien följde principerna i Helsingforsdeklarationen och hade fått godkännande av Institutional Review Board och Research Ethics Committee of College of Medicine, King Saud University, Riyadh, Saudiarabien.

Samtycke

Ett skriftligt informerat samtycke inhämtades från alla deltagare innan de ingick i studien.

Intressekonflikter

Författarna rapporterar inga intressekonflikter. Finansiären hade ingen roll i utformningen av studien, i insamling, analys och tolkning av data samt i skrivandet av manuskriptet. Författarna är ensamma ansvariga för innehållet och skrivandet av artikeln.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Vice Deanship of Scientific Research Chair och Gluacoma Research Chair in Ophthalmology vid King Saud University genom vilka detta arbete fick stöd.