Frontiers in Microbiology

Introduktion

Bakteriofager har hamnat i fokus för den vetenskapliga forskningen eftersom de spelar en viktig roll i nästan alla mikrobiella samhällen. Som virala predatorer av bakterier har de ett betydande inflytande på mikrobiella populationer och dynamik i olika miljöer. Det finns flera översikter som behandlar bakteriofagens roll i olika livsmiljöer, t.ex. i haven eller i människokroppen (Clokie och Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Sedan de upptäcktes för mer än 100 år sedan, separat av Frederick Twort och sedan av Felix D’Herelle (Salmond och Fineran, 2015), har bakteriofager använts i östeuropeiska länder för medicinsk behandling av bakterieinfektioner, medan det i resten av världen var antibiotika som var protagonisterna (Myelnikov, 2018). Numera, eftersom infektioner med multiresistenta bakterier har blivit ett globalt hot (Zaman et al, 2017), behandlas patienter från hela världen vid Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology, and Virology i Tbilisi, Georgien, som kanske har den längsta erfarenheten av bakteriofagterapi (Kutateladze och Adamia, 2008), och även vid enheten för bakteriofagterapi vid Ludwik Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy i Wrocław, Polen (Międzybrodzki et al., 2012). Tillämpningen av bakteriofager skulle inte bara kunna vara en värdefull lösning inom den medicinska sektorn, utan även inom andra områden där bakterier kan ha en negativ inverkan.

Vissa företag i USA som OmniLytics Inc. (Sandy, UT, USA) och Intralytix Inc. (Baltimore, MD, USA) har utvecklat olika bakteriofagprodukter för användning som desinfektionsmedel inom livsmedelsindustrin som kan användas mot Salmonella, Escherichia coli och Listeria monocytogenes. I Europa har ett nederländskt företag Micreos BV (Wageningen, Nederländerna) också marknadsfört bakteriofagprodukter mot Salmonella och E. coli och ett tyskt företag, Fink Tec (Hamm, Tyskland), som riktar sig mot E. coli (Moye et al., 2018). En bredare tillämpning av bakteriofager förväntas i livsmedelsvärdekedjan, inklusive jordbruk och vattenbruk, där ett brett spektrum av olika växt- och fiskpatogener orsakar betydande ekonomiska förluster (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Och även om en del bakteriofagprodukter redan har kommersialiserats, har en effektiv, konstant och kontrollerbar process för bakteriofagproduktion ännu inte uppnåtts. Produktionen av fager i laboratorier kan betraktas som en rutinprocess och protokollen är väldefinierade, men det är inte lätt att skala upp dessa processer. Industriella enheter har ett stort intresse av att få fram tillförlitliga metoder för produktion av fager som gör det möjligt att skala upp processen. Lösningen är dock inte lätt, på grund av systemets biologiska natur och de olika typer av interaktioner som sker mellan fager och bakterier.

Det har gjorts flera försök att generera tillförlitliga metoder för produktion av bakteriofager. Vissa forskare har använt ett teoretiskt tillvägagångssätt med simuleringsmodeller, medan andra har valt det praktiska tillvägagångssättet genom experiment. I den här minirecensionen granskas utvalda exempel på båda tillvägagångssätten, med kontrastering av deras huvudsakliga skillnader.

Generaliteter i bakteriofagproduktion

Bakteriofagens biologiska natur tvingar dem att reproducera sig i värdcellen. Därför kräver en metod för produktion av bakteriofager en produktionsprocess som omfattar minst två driftsenheter, tillväxt av värdbakterier och bakteriofagförökning (eller infektion). Det är viktigt att beakta grundläggande parametrar för bakterietillväxt och faginfektion, t.ex. de valda substraten för bakterien och den optimala temperaturen, både för bakterietillväxt och faginfektion, eftersom dessa faktorer kan påverka fagens infektionsförmåga (Tokman et al., 2016). På samma sätt är det viktigt att känna till biologin hos de fager som ska produceras, inklusive de olika infektionsparametrarna såsom adsorptionshastighet, burststorlek och latentperiod; men som kommer att diskuteras senare kan dessa parametrar förändras beroende på infektionsförhållandena (Santos et al., 2014). Ännu viktigare är att det rekommenderas att ha en djup förståelse för de specifika interaktioner som kan uppstå mellan den bakteriella värden och det utvalda faget, t.ex. närvaron av ett CRISPR-cas-system i bakterien, eftersom dessa faktorer kan ha ett starkt inflytande på faginfektionsprocessen (Levin et al., 2013). Det rekommenderas också att välja en icke virulent bakteriestam som värd. Bakteriofagproduktion på industriell nivå kommer att kräva stora mängder av värdbakterien, så att undvika användning av virulenta läkemedelsresistenta och särskilt multiresistenta patogener bör vara obligatoriskt i en fagproduktionsprocess (Torres-Barceló, 2018). Samma sak gäller för bakterier som bär profager, eftersom de kan induceras under processen och förändra slutresultatet (Stewart och Levin, 1984).

En tillförlitlig process för storskalig produktion av bakteriofager kan vara mycket svårfångad, eftersom data som erhålls i ett laboratorium inte alltid är användbara för uppskalning av biologiska processer (Kwok, 2010). Forskare har försökt fylla denna lucka främst genom studier om bakteriofagproduktion baserade på datorsimuleringar, varav vissa har validerats experimentellt. Här kommer vi att analysera först teoretiska studier med fokus på modeller för fagproduktion och sedan utvalda studier som har validerats experimentellt. Alla fall stämmer överens med testkriterierna för ytterligare rening och validering av en bakteriofagbaserad produkt, och några av dem ingår i båda avsnitten (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Teoretiska modeller för bakteriofagproduktion

För att beskriva en process för fagproduktion med hjälp av en matematisk modell är det viktigt att definiera de kinetiska parametrar som ska ingå i modellen. De tre grundläggande parametrarna för fagproduktion är populationerna av mottagliga oinfekterade bakterier, faginfekterade bakterier och fria fager (Krysiak-Baltyn et al., 2016). Med utgångspunkt i detta har olika modeller inkluderat ytterligare variabler såsom resistenta oinfekterade bakterier (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) eller flera bakteriearter (Levin et al., 1977). Alla dessa populationer interagerar och kontrolleras av kinetiska parametrar som är förknippade med bakterietillväxt och faginfektion. Det anses vara välkänt vilka konstanter som är viktiga för bakterier; detta diskuteras dock fortfarande för bakteriofager. Det råder enighet om att adsorptionskonstanten, latenstiden och burststorleken är viktiga variabler att ta hänsyn till, men deras relevans i modellen varierar mellan olika studier. Dessutom använder olika författare olika nomenklaturer för att definiera de kinetiska parametrarna, vilket är en av de största svårigheterna när det gäller att göra jämförelser mellan olika modeller och att förenhetliga den allmänna kunskapen om detta ämne. Till exempel hänvisas adsorptionshastigheten för fager (indikator för fagerpartiklar som adsorberas på bakterier) vanligen till symbolen ”δ”, men Beretta och Kuang (1998) använde symbolen ”K”, som också kan vara symbolen för Monods substratspecificitetskonstant ”Ks”. Andra exempel på olika nomenklaturer finns i tabell 1. Precis som i andra biologiska processer förväntas det att författare som arbetar med tillväxtmodeller för fag-bakterier kommer överens om en specifik algebraisk vokabulär eller inkluderar en tydlig förklaring av termer och enheter i sina artiklar och en tydlig nomenklatur, vilket nyligen konstaterades av Krysiak-Baltyn et al. (2018). Baserat på den nomenklatur som används av andra författare (tabell 1) föreslår vi att vi använder grekiska tecken för att benämna de olika kinetiska parametrarna i fagernas reproduktion. Burststorlek kan symboliseras med β, adsorptionshastighet med δ, förmörkelsetid med ε och fagenas nedbrytningshastighet med λ. De enda undantagen skulle vara fagkoncentrationen, som vanligen kallas ”P”, och latenstid, som kallas ”L”. Enhetlighet i detta matematiska språk kommer att underlätta förståelsen och datautvinning för framtida akademiska eller industriella granskare.

Med början hos Campbell (1961) har många ansträngningar gjorts för att beskriva modeller för produktion av bakteriofager, som beskriver fagpopulationens beteende under olika förhållanden och metoder. Tabell 1 sammanfattar olika modeller för fagproduktion, angivna som differential- eller integralekvationer (beroende på varje författares beslut), och nämner specifika överväganden för varje modell.

Modeller för fagproduktion är i allmänhet konsekventa när det gäller att beskriva förändringar i fagpopulationen över tiden. Detta kan representeras som en kinetisk förändring av fagpartiklar eller plackbildande enheter (PFU) per tidsenhet, slutkoncentrationer som erhålls efter en batchprocess eller under en tidsperiod i en kontinuerlig process. Trots det allmänna samförståndet skiljer sig dessa modeller åt i flera påståenden. Modeller som föreslagits av Campbell (1961) och Beretta och Kuang (1998) är konsekventa när det gäller att balansera fagpartiklar med genereringstermer (frisättning av bakteriofagpartiklar per tidsenhet) och förlust av fria bakteriofager på grund av adsorption eller nedbrytningshastigheter; dessa modeller är användbara på grund av sin enkelhet och användningen av standardparametrar för fagtillväxt, som adsorptionshastighet, burststorlek och latenstid, och de är ett snabbt sätt att simulera tillverkningsprocesser med satsvis produktion, men de kan inte passa processer som resistenta bakteriepopulationer eller fagutveckling över tiden. Dessa modeller tenderar också att underskatta inflytandet av parametrar som burststorlek och latenstid, medan nyare modeller har visat betydelsen av dessa parametrar och hur de kan variera beroende på andra faktorer (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

En intressant modell som nyligen föreslogs av Santos et al. (2014) tar hänsyn till bakterietillväxtens inflytande på fagets adsorptionskonstant och en normalfördelningsekvation som reglerar värdena för latenstiden, med hänsyn till variabiliteten i dessa parametrar. Denna modell har visat sig vara mycket användbar eftersom den ger möjlighet att utvärdera substratets inflytande på fagproduktionen, och genom att inkludera den bakteriella tillväxthastigheten i modellen erbjuds ett indirekt verktyg för att beakta bakteriernas fysiologiska tillstånd under processen. Bakteriofaginfektionsparametrarnas beroende av bakterietillväxthastigheten har senare också undersökts av andra författare (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al, 2018b); Nabergoj och kollegor fann att burststorleken ökade linjärt med den bakteriella tillväxthastigheten, medan adsorptionskonstanten och latentperioden minskade.

Andra modeller har utforskat påverkan av flera bakteriearter och förekomsten av bakteriell resistens (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Även om syftet med dessa studier inte alltid var att utveckla metoder för fagproduktion är de användbara för att beskriva potentiella situationer som kan uppstå under processen. Dessa modeller omfattar variabler som är förknippade med urval av bakterieresistens och reversionshastigheter som en funktion av bakteriepopulationen (tillgång till mindre eller mer mottagliga bakterier över tiden), som definierar villkor där mottagliga och resistenta bakterier kan samexistera, t.ex. en stark selektiv nackdel hos resistenta bakterier (t.ex. lägre tillväxthastighet) och/eller förekomsten av en rumslig tillflyktsort (eller täthetstillflyktsort) där (under vilken) faget inte kan infektera bakterierna. Chaudhry et al. (2018) gav en intressant förklaring till hur fager kan bestå i populationer som domineras av resistenta bakterier, och föreslog att de senare skulle kunna producera mottagliga bakterier i frekvenser som skulle möjliggöra replikation av fager. Intressant nog har detta fenomen föreslagits tidigare (Bastías et al., 2010). Generering av fageresistenta stammar i system för produktion av fager kan vara ett problem och bör därför ingå i utvecklingen av nya metoder för att minimera denna möjlighet. Flera författare har föreslagit att detta problem kan undvikas med upplägget för fagproduktion, vilket kommer att diskuteras i nästa avsnitt.

En annan intressant studie är den av Krysiak-Baltyn et al. (2018), som också införlivar variabla infektionsparametrar som en funktion av bakterietillväxthastigheten, och uppskattar driftskostnad och produktivitet i ett simulerat tvåstegsprocessystem. En av de viktiga slutsatserna i denna teoretiska studie är att den optimala substratkoncentrationen för bakterietillväxt inte nödvändigtvis bör vara densamma för produktion av bakteriofager, och enligt deras analys kan kostnaden per mL fager vid en koncentration på 4 × 1010 fager/mL vara så låg som 1,78 × 10-2 dollar. Det skulle vara intressant att få en experimentell validering av denna uppskattning och fastställa hur den är anpassad till olika ekonomier eller länder.

För det sista måste bakteriofagernas utveckling också beaktas i en produktionsprocess, eftersom fagerna kan öka eller minska sin effektivitet att infektera bakterier med tiden (Lenski och Levin, 1985). Detta koncept skulle kunna representeras som infektionsfrekvenser i värdskapsförsök, där även metoder för värdskapsutvidgning kan uppnås för fagterapitillämpningar (Mapes et al., 2016). Denna situation har simulerats i batchkulturer, vilket visar att uppkomsten av fagmutanter är starkt beroende av fagernas genetiska flexibilitet (mutationshastigheter) (Levin och Bull, 2004). Förmågan att förutsäga fagenas utveckling under produktionen skulle vara till hjälp för att ställa in en produktionsprocess som minimerar sannolikheten för att förändra fagornas lytiska egenskaper. De granskade artiklarna visar att modeller för bakteriofagproduktion är ett viktigt tillvägagångssätt som kan hjälpa till att hitta de bästa strategierna, men de måste dock valideras experimentellt.

Experimentella erfarenheter av bakteriofagproduktion

Det finns flera praktiska studier som involverar produktion av fager. Vissa är inriktade på fagproduktion i bioreaktorer, medan andra fokuserar på utvärdering och optimering av processen. Som väntat tar dessa erfarenheter också hänsyn till ett steg av bakterietillväxt och fagerinfektion/förökning i kolvar och bioreaktorer (tabell 2). Dessa uppgifter är användbara för att ge insikter om hur vissa modeller av värd-bakteriofager kan användas för förökning och öka nivåerna av fagproduktion. De vanligaste värd-fagsystemen som används är E. coli-stammar och deras fager, förmodligen på grund av mängden information om dessa bakterie-fagsystem (E. coli-fagerna T3, T4 och T7) och bristen på information om andra bakterie-fagsystem.

Enligt ett rapporterat fall kan de erhållna titrarna vara så höga som 1,2 × 1016 PFU mL-1 i en batchbioreaktor (5 L) (Sochocka et al., 2015). Denna produktionsnivå stämmer överens med den produktion som behövs för terapeutiska ändamål (>1 1010 PFU mL-1), med hänsyn till reningssteg, fagernas nedbrytningshastighet och stabilitet eller hållbarhet (Naghizadeh et al., 2018). Andra författare har också rapporterat lovande produktionsnivåer på 5 × 1012 PFU mL-1 i 1,2 L (Warner et al., 2014) och 2,4 × 1013 PFU dag-1 i 1 L (Nabergoj et al., 2018a; tabell 2).

Det är svårt att upprätta jämförelser om vilken metod som skulle kunna vara effektivare, eftersom de använder olika odlingsförfaranden och olika värd-bakteriofager-system. Batchodling är det billigaste (inte enklaste) sättet att producera bakteriofager, men det är starkt begränsat av den maximala volymen av den tillgängliga utrustningen, den totala drifttiden och substrattillgången (högre koncentrationer kan vara hämmande för bakterietillväxt). Kontinuerlig odling har högre skalbarhet när man optimerar bakterieutspädningshastigheten genom att modifiera in- och utloppsflödet. Dessutom kommer reglering av utspädningshastigheten att möjliggöra direkt kontroll över bakterietillväxthastigheten, vilket har en direkt påverkan på infektionsparametrar som burststorlek, adsorptionskonstant och latentperiod (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). Utspädningshastigheten kan också användas för att öka systemets produktivitet, vilket visades av Nabergoj et al. (2018a) där en maximal fagerproduktivitet på 109 fager mL-1 h-1 uppnåddes med en låg utspädningshastighet på 2 h-1 i ett 1 L cellstat-system. Ett system med kontinuerlig drift kan vara permanent operativt och är därför det mest bekväma sättet att producera en bioteknisk produkt för ett företag. De är dock svåra och dyra att genomföra och kräver ständig övervakning för att upprätthålla det stabila tillståndet. En helt kontinuerlig process för bakterietillväxt och bakteriofagproduktion kan öka sannolikheten för att bakteriofagresistens uppstår om inte särskilda motåtgärder vidtas (Middelboe et al., 2001).

Vissa författare har föreslagit att man ska genomföra tvåstegsprocesser, en uteslutande för bakterieproduktion och en andra för förökning av fager (Schwienhorst et al., 1996; Sauvageau och Cooper, 2010; Nabergoj et al., 2018a). Detta kan uppnås med ett cellstat-system, där två bioreaktorer är kopplade i serie med ett konstant flöde genom systemet. I detta fall kan flödet mellan reaktorerna och volymen i varje reaktor (samt utspädningshastigheten och bakterietillväxten genom tillsats) styras för att nå maximal produktivitet (Nabergoj et al., 2018a). En annan intressant uppställning som föreslagits av Sauvageau och Cooper (2010) består av ett halvkontinuerligt system av en självcyklande process i två steg. I det här fallet fungerar varje steg på samma sätt som en batchkultur, där bakterierna först odlas separat från fagen och sedan introduceras i fagförökningssteget när en lämplig koncentration har uppnåtts, vilket gör det möjligt att inleda infektionsprocessen med hjälp av en önskad infektionsmultiplicitet (Kasman et al., 2002). Denna uppställning har också fördelen att den inte kräver ständig övervakning för att upprätthålla det stabila tillståndet i kontinuerliga system, och har använts för att uppnå en produktivitet på 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau och Cooper, 2010). Båda exemplen, cellstat-systemet och den självcyklande processen i två steg, har den stora fördelen att bakterier odlas i frånvaro av fager, därför gynnas inte bakteriofageresistens under processen.

Slutligt är det viktigt att notera att det finns vissa parametrar som inte alltid rapporteras i studier om bakteriofagproduktion. Till exempel nämns parametrar som luftningsandel eller luftinflöde i bioreaktorn endast i två rapporter (Sauvageau och Cooper, 2010; Santos et al., 2014), trots att detta är en av de viktigaste parametrarna vid produktion av bakteriofager på industriell nivå. Information om andra parametrar som energiöverföring, olika substratutnyttjande, bioreaktorns utformning, omrörning, propellrar och konstruktionsmaterial vid produktion av bakteriofager är knapphändig eller obefintlig.

Slutsats

Redovisningen av den potentiella användningen av fager i ett brett spektrum av tillämpningar är mycket spännande och lovande. Bevisen tyder på att system för produktion av bakteriofager som minskar sannolikheten för att bakteriofageresistens uppstår bör föredras, t.ex. en cellstat eller en självcyklingsprocess i två steg. Dessa alternativ skulle också göra det möjligt att kontrollera variabler för att öka processens produktivitet. Modellerna för produktion av bakteriofager är dock långt ifrån etablerade och kan förbättras på flera sätt. Det finns fortfarande många utmaningar som måste övervinnas. Det behövs ytterligare studier om optimerad storskalig produktion av bakteriofager, kostnader för infrastruktur och utrustning, olika säkerhetsproblem och användningsdoser, och erfarenheten tyder på att dessa utmaningar bör mötas i samarbete mellan akademiska och industriella partner.

För det sista är det viktigt att notera att de flesta modellerna för produktion av bakteriofager kan tillämpas inom ett visst värdeintervall för parametrarna för fagerinfektion och bakterietillväxt. Därför, oavsett de viktiga framstegen i modeller och uppställningar för fagproduktion, kommer den djupa kunskapen om det specifika fag-bakteriesystemet alltid att vara det första kravet för att etablera ett effektivt fagproduktionssystem.

Författarbidrag

RG, SL och RB har tänkt ut arbetet och skrivit manuskriptet. KG, GH och JR skrev delar av manuskriptet. Alla författare bidrog till den bibliografiska revideringen, revidering av manuskriptet, läste och godkände den inlämnade versionen.

Finansiering

Detta arbete finansierades av CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 och Postdoctorado PUCV 2018.

Intressekonfliktförklaring

Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

RG tackar CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL tackar Postdoctorado PUCV 2018.

.