Genetiska polymorfismer av cytokrom P 450 2D6 (CYP2D6): kliniska konsekvenser, evolutionära aspekter och funktionell mångfald

Farmakogenetik som behandlar ärftliga skillnader i läkemedelsmål och läkemedelsdisposition i form av läkemedelsreceptorer och läkemedelstransportörer utvecklas snabbt.1, 2, 3, 4, 5 För närvarande är vår kunskap mest avancerad när det gäller påverkan av polymorft fördelade gener som kodar för läkemedelsmetaboliserande enzymer, även om kunskapen om läkemedelsreceptorer och läkemedelstransportörer växer snabbt. Den största betydelsen för de interindividuella skillnaderna i läkemedelsrespons har för närvarande skillnaderna i kapacitet för läkemedelsmetabolism som orsakas av genetisk polymorfism eller av hämning eller induktion av läkemedelsmetabolism. Förutom interaktioner mellan läkemedel och läkemedel, patofysiologiska faktorer och miljöfaktorer spelar genetiken hos de enzymer som metaboliserar läkemedel en avgörande roll för förståelsen av interindividuella skillnader i läkemedelsrespons och biverkningar av läkemedel. Den största påverkan bland de läkemedelsmetaboliserande enzymerna utövas av cytokromerna P450, de viktigaste fas I-enzymerna.6, 7 Bland dessa är CYP2C9, CYP2C19 och CYP2D6 mycket polymorfa och står tillsammans för cirka 40 % av den hepatiska mänskliga fas I-metabolismen. Dessutom bidrar polymorfismerna hos CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6 och CYP2C8 också till interindividuella skillnader i läkemedelsmetabolismen. CYP2D6 är kanske det mest omfattande studerade polymorfiskt uttryckta läkemedelsmetaboliserande enzymet hos människor; dess polymorfism har stor klinisk betydelse och var den första av de polymorfa P450 som karakteriserades på molekylär nivå. I dag har mer än 48 olika läkemedelssubstrat för detta enzym identifierats (tabell 1) och CYP2D6 ansvarar för cirka 25 % av metabolismen av kända läkemedel. Detta kan dock vara en liten överskattning eftersom man tidigare särskilt har letat efter läkemedel som metaboliseras av detta enzym på grund av dess polymorfiska uttryck. I denna översikt beskrivs den nuvarande kunskapen om och konsekvenserna av CYP2D6:s molekylärgenetik samt kunskapen om dess inverkan på läkemedelsbehandlingen.

Allmänna kännetecken för CYP2D6

CYP2D6 är en polypeptid med 497 aminosyror. Enzymet utgör endast en liten andel av alla hepatiska P450, men dess roll i läkemedelsmetabolismen är betydligt större än dess relativa innehåll (se Zanger et al8). De olika modellerna av enzymet som bygger på den tredimensionella strukturen av cytokrom P450 BM-3 eller CYP2C5 och resultaten från platsstyrd mutagenes skiljer sig mycket från varandra. Trots att man lyckats få fram väl diffrakterande kristaller av däggdjurens CYP2B4, CYP2C5, CYP2C9 och CYP3A4 har man ännu inte lyckats få fram bra CYP2D6-kristaller. Man tror att sådana kristaller är nödvändiga för att få fram en mall för modeller med tillräcklig upplösning och noggrannhet för att t.ex. kunna förutsäga vilka läkemedel som kommer att vara substrat för detta enzym. En sådan modell skulle vara av stor betydelse för läkemedelsindustrin eftersom en läkemedelsdesign där man undviker att föreningar är substrat med hög affinitet för CYP2D6 är central för en framgångsrik produkt på marknaden.

CYP2D6-substrat är lipofila baser med en protonbar kväveatom. Hydroxyleringsreaktionen sker på ett avstånd av 5 eller 7 Å från kväveatomen. Platsstyrda mutationsexperiment visar att Asp301 är den negativt laddade aminosyra som ansvarar för att binda till substratets kväve.8 Dessutom verkar även Ser304, Thr309 och Val370 vara involverade i substratbindningen9 , även om det krävs ytterligare modeller för att bekräfta detta.

CYP2D6 har en mycket hög affinitet för alkaloider (se tabell 1).10 Enzymexpressionen är, i motsats till andra hepatiska cytokrom P450 som metaboliserar xenobiotiska ämnen, inte reglerad av något känt miljöämne och är inte inducerbar av kända hormoner. Eftersom ingen fenotyp har beskrivits hos personer som saknar CYP2D6 eller har upp till 13 aktiva genkopior, kan man dra slutsatsen att enzymet inte har någon viktig endogen funktion. En roll för metabolismen av vissa neurotransmittorer har föreslagits. Det har nyligen framkommit bevis för att CYP2D6 är ett specifikt 5-metoxiindoletylamin O-demetylas,11 och även 5-metoxitryptamin12 har visat sig vara ett substrat. Förutom sådana substrat är det troligt att enzymet har en viktig roll för metabolismen av livsmedelsbeståndsdelar, särskilt alkaloider (se nedan).

Den verkan som CYP2D6 har på substrat med potentiell aktivitet i hjärnan skulle innebära en funktionell fenotyp på försökspersoner, det vill säga fattiga metaboliserare (PM) som saknar enzymet. Två studier har faktiskt visat på ett signifikant samband mellan beteende med hjälp av psykologiska tester och förekomsten av CYP2D6.13, 14 Frågan uppstår om en sådan aktivitet är väsentlig. Intressant nog har Pai et al15 nyligen bevisat att en vanlig variant av pseudogenen CYP2D7P kan uttryckas i aktiv form i mänsklig hjärna och ge en funktionell enzymprodukt som är aktiv i metabolismen av till exempel kodein. Huruvida detta utgör en produkt av verklig funktionell betydelse återstår att klarlägga, även om fyndet som sådant är av intresse.

CYP2D6-polymorfism-historiska aspekter

Polymorfismen av CYP2D6 upptäcktes oberoende av varandra i tre olika laboratorier. Folke Sjöqvists laboratorium visade att metabolismen av nortriptylin och desimipramin, som senare visade sig vara CYP2D6-substrat, uppvisade en enorm interindividuell variation i plasmanivåer vid samma dosering och två fenotyper identifierades.16 Senare studier av Sjöqvists grupp med hjälp av tvillingar avslöjade att skillnaden var genetisk till sin natur. Bob Smith och medarbetare i London studerade ämnesomsättningen av två antihypertensiva läkemedel bethanidin och debrisoquin, som användes mot hypertoni. När Bob Smith i maj 1975 tog 40 mg debrisoquine blev han yr, svimmade och drabbades av svår hypotoni. En efterföljande studie med 10 mg debrisoquine på 94 försökspersoner identifierade de två fenotyperna.17 Michel Eichelbaum i Bonn studerade de antiarrytmiska effekterna av spartein och två försökspersoner klagade över obehagliga biverkningar som suddig syn, diploida, yrsel och huvudvärk. Analys av plasmanivåerna visade att de hade 4-5 gånger högre nivåer än de andra och de två fenotyperna publicerades 1978 och 1979.18, 19

Den genetiska grunden bakom debrisoquinpolymorfismen klarlades 10-15 år senare. I en samarbetsstudie mellan Urs Meyers och Frank Gonzalez laboratorier användes polyklonala CYP2D-antikroppar från råttor som utvecklats i Basel som verktyg för att klona det humana CYP2D6 cDNA:t från ett cDNA-bibliotek från mänsklig lever λgt 11. Det uttryckta cDNA:t hade den förväntade bufuralolhydroxylasaktiviteten20 . Med hjälp av RFLP kunde Meyers labb bekräfta förändrade RFLP-mönster i PM för debrisoquin,21 medan den fullständiga identifieringen av CYP2D6*3- och CYP2D6*4-allelerna publicerades 1990.22

I slutet av 1980-talet identifierade vi i ett fruktbart samarbete med Leif Bertilsson och Folke Sjöqvist ett RFLP-mönster hos kineser som är aktivt i CYP2D6-metabolismen, vilket indikerar PMs hos kaukasier23 och senare karakteriserade vi den vanligaste delvis defekta CYP2D6-allelen hos orientaler, CYP2D6*10.24 Eftersom en fransk grupp motsatte sig vår storleksidentifiering av de kinesiska XbaI-fragmenten och vi undersökte på nytt flera olika DNA-prover med XbaI RFLP genom att använda en lägre densitet på agarosgelen och hittade några prover som vi trodde hade ostyckat DNA (se Ingelman-Sundberg25 för mer information). En undersökning av deras ursprung visade dock att de kom från individer som var mycket snabba när det gäller debrisoquinmetabolism och ämnen med upp till 12 extra CYP2D6-genkopior identifierades. Detta visade sig vara den första beskrivningen av en stabilt amplifierad aktiv gen hos människor26 och termen ultrarapida metaboliserare (UMs) definierades.27 Senare undersökningar av frekvensen i olika populationer visade att 30 % fanns hos etiopier28 , 10 % hos spanjorer och 10 % av befolkningen i Italien och Turkiet, medan UMs är ovanliga (1-2 %) i Nordeuropa och i stort sett obefintliga i Asien (se6 för referenser). Hos etiopier fann vi ingen individ som var homozygot för defekta CYP2D6-gener utan alleler som innehöll 2, 3, 4 samt 5 CYP2D6-genkopior.28 En liknande situation sågs också hos saudiaraber.29 Utvärdering av antalet försökspersoner som bär på CYP2D6-gendubbleringar i Västeuropa visar att 5,5 % av européerna bär på mer än två aktiva CYP2D6-genkopior och är UM (tabell 2).

CYP2D6 Genetisk polymorfism

CYP2D6-genen är lokaliserad på kromosom 22q13.1. Lokus innehåller två angränsande pseudogener, CYP2D7 och CYP2D8.30 Utvecklingen av det mänskliga CYP2D-lokus har inneburit eliminering av tre gener och inaktivering av två (CYP2D7P och CYP2D8P) och partiell inaktivering av en (CYP2D6). För närvarande finns det mer än 46 kända olika polymorfa CYP2D6-alleler. Närvaron av mycket likartade, nära belägna pseudogener med skadliga mutationer har till exempel genom ojämna korsningsreaktioner lett till att många av de varierande CYP2D6-allelerna, som oftast kodar för defekta genprodukter, har bildats. ”Aktiviteten” i CYP2D-lokusen är hög jämfört med t.ex. CYP2C-lokusen och som ett resultat av detta har många varianter av alleler bildats under en relativt kort tidsperiod. De vanligaste variantallelerna fördelade i olika etniska grupper anges i tabell 3 och alla variantalleler presenteras på hemsidan för kommittén för nomenklatur av mänskliga CYP-alleler (http://www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm). De alternativa CYP2D6-allelerna kan klassificeras i kategorier som orsakar avskaffad, minskad, normal, ökad eller kvalitativt förändrad kataxlytisk aktivitet. Bland de viktigaste varianterna finns CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 och CYP2D6*41.

Den vanligaste allelen hos asiater (allelfrekvens >50 %) och därmed kanske den vanligaste CYP2D6-allelen i världen är CYP2D6*10.24 CYP2D6.10-enzymet har en skadlig P34S-mutation som avskaffar den viktiga PPGP-sekvensen som är nödvändig för P450:s veckning, och det är därför mycket instabilt,24 men det har också en minskad affinitet för substratet.31 Bland svarta är CYP2D6*17, som först beskrevs 199632 , den viktigaste varianten av CYP2D6-allelen. Den kodar förutom för de två missense-mutationer som ses i CYP2D6*2 även för T107I, som uppenbarligen ger en förändrad struktur på den aktiva platsen. Detta skapar en förändrad substratspecificitet,33 vilket är uppenbart in vitro33 men också när personer med CYP2D6*17-genotypen fenotypas in vivo.34, 35 Generellt sett är aktiviteten hos CYP2D6.17-enzymet lägre än vildtypenzymet.

CYP2D6*41 är en variant av CYP2D6*2 som har -1584 C i stället för G. Den uttrycks mindre än motsvarande CYP2D6*2-allel (se Zanger et al36). Det är troligt att -1584G>C befinner sig i kopplingsdifferens med en annan SNP som orsakar bristfällig skarvning av mRNA, även om detta måste visas uttryckligen. Effekten in vivo av CYP2D6*41 är dock ganska uttalad och försökspersoner som är homozygota för denna allel liknar fenotypiskt individer med den intermediära fenotypen (IM) med en bristfällig CYP2D6-allel.36

Utveckling av CYP2D-loci

Det finns en drastisk skillnad mellan gnagare och människor i antalet aktiva CYP2D-gener. Medan musen har nio olika aktiva Cyp2d-gener37 har människan endast en, som faktiskt saknas hos 7 % av den kaukasiska befolkningen (figur 1). CYP2D6-enzymet är känt för att ha en mycket hög affinitet för växtgifter som alkaloider.10 Det är rimligt att anta att musen har behållit generna aktiva på grund av behovet av en avgiftningspotential via kosten, medan den mer begränsade mat som människor tidigare har ätit, inklusive den intellektuella förmågan att överföra information om lämplig mat mellan generationer, har lett till att selektionstrycket för att hålla generna aktiva har försvunnit.

Cyp2D6-genen är inte inducerbar i vanlig mening genom ökat genuttryck av uttryck av genprodukten. Hos Drosophila sker ett selektivt urval av stammar som lever i t.ex. området med Senita-kaktusen som utsöndrar giftiga isokinolinalkaloider och endast Drosophila mettleri men ingen Drosophila melanogaster-stam överlever i detta område på grund av deras förmåga att inducera CYP6 och CYP28.38 Ett intressant genetiskt urval sker också hos Drosophila som är motståndskraftig mot insekticider. Från 1930 till 1960 har insekticidresistenta fläckar utvecklats snabbt. Intressant nog tycks den molekylärgenetiska grunden vara selektion för en insättning av en transposom (accordelement) i den 5′-regulatoriska regionen av Cyp6b-genen, vilket leder till 40- till 100-faldigt högre uttryck av genprodukten.39 En annan mekanism för att förvärva resistens mot insekticider hos Drosophila exemplifieras av selektion för tre nyckelmutationer i CYP6A2, det vill säga R335S, L336V och V476L, vilket gör enzymet aktivt för metabolism av DDT.40 En illustration av tre olika mekanismer för adaptiv respons mot substratstress visas i figur 2.

Samma har vi föreslagit att ett sådant urval har skett för alleler som bär på flera aktiva CYP2D6-gener i Nordostafrika. Grunden för detta urval skulle vara CYP2D6-enzymets förmåga att avgifta alkaloider, vilket ökar tillgången på potentiella livsmedel bland bärare av flera CYP2D6-genkopior. Detta skulle vara mycket fördelaktigt för överlevnaden under perioder av svält när endast en bråkdel av populationen i denna region når mognad. En undersökning av hastigheten för metabolismen av debrisoquin hos etiopier som lever i Etiopien jämfört med etiopier som lever i Sverige visade att infödda etiopier av samma genotyp var långsammare i sin metabolism jämfört med etiopier i Sverige, medan inga signifikanta skillnader hittades i hastigheten för CYP2C19-beroende katalytiska reaktioner som mättes med S-mefenytoin41 . Detta kan tolkas på så sätt att beståndsdelar i den etiopiska maten, förmodligen alkaloider, hämmar CYP2D6-aktiviteten och att sådana beståndsdelar faktiskt skulle kunna vara en utlösande faktor för genetiskt urval. Vi föreslår att den etiopiska befolkningen expanderade för cirka 10 000-20 000 år sedan i en sådan omfattning att maten uppvisade en viktig begränsning. Under perioder av svält har det uppstått ett selektionstryck som gynnar överlevnad av individer som kan avgifta växtgifter i högre grad, vilket ökar antalet växter som kan ge användbar föda (figur 3). Detta skapade en expansion av subpopulationer med flera kopior av aktiva CYP2D6-gener och även utan inaktiva CYP2D6-gener. Eftersom de överlägset vanligaste varianterna av CYP2D6-genen som duplicerats och multiduplicerats är CYP2D6*2 och CYP2D6*41, som båda skapar två aminosyrasubstitutioner jämfört med CYP2D6*1, kan man spekulera i att substratspecificiteten hos denna form av enzymet är fördelaktig för metabolismen av vissa växtprodukter. Den efterföljande migrationen av personer från nordöstra Afrika till Medelhavsområdet resulterade i den höga frekvensen av UMs i Sydeuropa (se tabell 2).

.