- Abstract
- 1. Introduktion
- 2. Material och metoder
- 2.1. Subjekt
- 2.2. Blodprovtagning
- 2.3. Extraktion av mononukleära celler från perifert blod (PBMC)
- 2.4. RNA-extraktion och cDNA-syntes
- 2.5. Design av primers
- 2.6. Utvärdering av de biokemiska faktorerna i serum
- 2.7. Analys och tolkning av resultat
- 3. Resultat
- 3.1. Resultat av qRT-PCR
- 3.2. Utvärdering av genuttryck i PBMC
- 4. Diskussion
- Interessentkonflikter
- Acknowledgments
Abstract
ABCA1- och ABCG1-gener kodar för kolesteroltransportproteiner som spelar en nyckelroll i kolesterol- och fosfolipidhomeostasen. Denna studie syftade till att utvärdera och jämföra ABCA1- och ABCG1-genernas uttryck hos patienter med metaboliskt syndrom och friska individer. Denna fall-kontrollstudie utfördes på 36 patienter med metabolt syndrom och lika många friska individer i Hamadan (västra Iran) under 2013-2014. Totalt RNA extraherades från mononukleära celler och renades med hjälp av RNeasy Mini Kit-kolonn. Uttrycket av ABCA1- och ABCG1-generna utfördes med qRT-PCR. Lipidprofilen och fasteblodsglukos mättes med hjälp av kolorimetriska förfaranden. ABCG1-uttrycket hos patienter med metabolt syndrom var signifikant lägre (ca 75 %) jämfört med kontrollgruppen, medan det för ABCA1-uttrycket inte fanns någon signifikant skillnad mellan de två undersökta grupperna. Jämförelse av andra parametrar såsom HDL-C, FBS, BMI, midjeomkrets samt systoliskt och diastoliskt blodtryck mellan patienter med metaboliskt syndrom och friska individer visade på signifikanta skillnader (). Minskat ABCG1-uttryck hos patienter med metaboliskt syndrom jämfört med friska individer tyder på att hyperglykemi, relaterade metaboliter och hyperlipidemi över transportörkapaciteten resulterade i minskat uttryck av ABCG1. Avsaknad av en signifikant förändring av ABCA1-genuttrycket mellan två grupper kan tyda på en annan regleringsmekanism för ABCA1-uttrycket.
1. Introduktion
Det metabola syndromet (MetS) definieras som en uppsättning samverkande riskfaktorer för diabetes och kardiovaskulära sjukdomar (CVD) . Det finns vissa kriterier för klinisk diagnos av metabola syndromet som inkluderar förhöjd midjeomkrets (≥102 cm hos män och ≥88 cm hos kvinnor), förhöjda triglycerider (≥150 mg/dL eller 1.7 mmol/L), minskat högdensitetslipoproteinkolesterol (HDL-C <40 mg/dL eller 1,03 mmol/L hos män och <50 mg/dL eller 1,3 mmol/L hos kvinnor) och förhöjt blodtryck (≥130 mm Hg systoliskt blodtryck eller ≥85 mmHg diastoliskt blodtryck) . MetS kan diagnostiseras genom observation av tre av dessa kriterier. Under de senaste åren har förekomsten av MetS ökat i hela världen, men i USA har den minskat från 25,5 % 1999/2000 till 22,9 % 2009/2010 . Weiss och medarbetare rapporterade att fetma är direkt förknippat med ökad förekomst av MetS . Det finns ett omvänt samband mellan CVD och HDL-C-nivån i plasma, ett av kriterierna för det metabola syndromet . Högdensitetslipoprotein, en delfraktion av cirkulerande lipoproteiner, spelar en viktig roll i kolesteroltransporten från perifer vävnad till leverceller . HDL är rikt på Apo A-I och Apo A-II-proteiner, och mer än två tredjedelar av dess innehåll är Apo A-I .
ABC-transmembrantransportörerna har en viktig roll i kolesterolupptagningen från makrofag till HDL och minskar bildandet av skumceller . ABCA1 består av 2261 aminosyror och finns i de flesta vävnader. På senare år har det visats att ABCA1 spelar en viktig roll för att skydda mot kardiovaskulära sjukdomar . HDL-syntesen är direkt beroende av ABCA1-aktiviteten i leverceller; med andra ord har den en nyckelfunktion i artärcellernas skydd mot skumceller genom att öka plasma-HDL. Arteriella makrofager ABCA1-aktivitet har visat ett omvänt samband med skumcellsbildning, eftersom med en ökning av dess aktivitet kommer bildandet av skumceller att minska .
Den minskade eller nedsatta ABCA1-aktiviteten skulle kunna orsaka vissa sjukdomar som typ 2-diabetes , Tanger-sjukdom och för tidig CVD .
ABCG1-genen ligger på kromosom 21q22.3 . Både ABCA1 och ABCG1 leder till en minskning av vävnadskolesterol genom dess utflöde till HDL, men ABCG1 transporterar vävnadskolesterol till HDL2 och HDL3 och ABCA1 transporterar det till lipidfri Apo A-I . Makrofager är den viktigaste vävnaden för ABCA1 och ABCG1 . I många studier undersöktes effekterna av upp- och nedreglering av dessa gener.
Reducerat kolesterolutflöde är följden av bristande ABCA1-uttryck in vitro ; det kan leda till ökad ateroskleros , men uppreglering av ABCA1 resulterar i minskad ateroskleros . Nedreglering av ABCG1 har också samma effekter på kolesterolutflödet, men det finns kontroversiella resultat om hur nedreglering av ABCG1 påverkar ateroskleros.
I MetS förändras uttrycksmönstren för vissa gener, vilket kan leda till fetma, diabetes och högt blodtryck. I denna studie syftade vi till att utvärdera ABCA1- och ABCG1-genernas uttryck hos patienter med MetS, eftersom dessa gener är involverade i transportersyntesen som har en avgörande roll i kolesteroltransporten.
2. Material och metoder
2.1. Subjekt
Denna fall-kontrollstudie genomfördes på patienter som hänvisades till en endokrinologisk avdelning på ett sjukhus i Hamadan (västra Iran) under 2013-2014. Trettiosex patienter med metabolt syndrom valdes ut. Dessutom valdes 36 ålders- och könsmatchade friska individer ut som kontrollgrupp. Ingen av de friska individerna hade kriterierna för metabolt syndrom.
Inklusionskriteriet i gruppen med metabolt syndrom var att ha tre av fem av de ovan nämnda egenskaperna. Patienter med en historia av konsumtion av antilipid-, preventiv- och diuretiska läkemedel uteslöts från studien. Gravida patienter och patienter med diabetes, inflammation och infektion exkluderades också.
2.2. Blodprovtagning
Ett blodprov på 2,5 ml från varje försöksperson lades i ett EDTA-innehållande rör och förvarades vid 4 °C för RNA-extraktion (högst två timmar senare).
2.3. Extraktion av mononukleära celler från perifert blod (PBMC)
Lymphodex (Tyskland) och Henx (Iran) lösningar användes för isolering av PBMC. Ungefär 2 mL Henx-lösning tillsattes till lika stor volym blod och blandades helt och hållet; sedan hälldes det på 3 mL Lymphodex-lösning försiktigt och långsamt. Därefter placerades blandningen på Lymphodex och centrifugerades vid 1000 g i 20 minuter. Det vita mellanskiktet mellan plasma och Lymphodex isolerades som mononukleära celler (MC); därefter tillsattes Henxbuffert på MC, blandades helt och hållet och centrifugerades. Slutligen kastades supernatanten och processen upprepades en gång till.
2.4. RNA-extraktion och cDNA-syntes
Nettoextraktionen av RNA utfördes med hjälp av Gene JET RNA Purification kit enligt tillverkarens protokoll. Det renade RNA:s kvalitet och kvantitet analyserades med NanoSpectrophotometer (Epoch, BioTek, USA); därefter undersöktes integriteten hos varje RNA-prov med hjälp av 1 % agarosgel, 1x TBE.
RNA konverterades till cDNA med hjälp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) genom att följa följande protokoll: steg 1: primer annealing vid 25°C i 5 minuter; steg 2: cDNA-syntes vid 42°C i 60 minuter; steg 3: värmeinaktivering vid 70°C i 5 minuter. Produkterna förvarades vid -80°C för nästa steg.
2.5. Design av primers
De specifika primers för varje gen designades med programvaran Allele ID (version 7.6). För att öka realtids-PCR-reaktionens specificitet och minska de falskt positiva resultaten utformades ett av varje primerpar så att det fästes vid Exon-Exon-övergångsområdet. De noggranna kriterierna för de använda primrarna för varje gen presenteras i tabell 1. 18S rRNA-hushållningsgenen användes som intern kontroll.
|
Det relativa uttrycket av generna beräknades genom att mäta tröskelcykelvärdet (CT) för varje prov med hjälp av C1000 Thermocycler och CFX96 realtidssystem (Bio-Rad, USA) och SYBR Premix Ex Taq 2 Kit (TakaRa nr RR820L). Genomsnittet av CT i tre exemplar av varje prov fastställdes som CT-värde. Ingrediensmängderna för qRT-PCR-reaktionen omfattade 10 μL SYBR-grönt, 7 μL avjoniserat vatten och 1 μL av var och en av framåtprimerna, bakåtprimerna och mallen. qRT-PCR utfördes under dessa förhållanden: inledande aktivering vid 95 °C i 30 sekunder och sedan 40 cykler med följande steg som upprepades: denaturering vid 95 °C i 5 sekunder, glödgning vid optimerad glödgningstemperatur för lämplig varaktighet för varje gen och förlängning vid 72 °C i 30 sekunder, och i slutet av processen förvärvades data genom att öka temperaturen från 72 °C till 95 °C i 0,5 °C/0,05 sekunder. Därefter elektroforeserades PCR-produkterna (på 1 % agarosgel, 1x TBE) för att verifiera amplikonernas specificitet.
2.6. Utvärdering av de biokemiska faktorerna i serum
Ett blodprov på två milliliter samlades in från varje försöksperson och centrifugerades vid 3000 rpm i 10 minuter för serumseparation. Totalt kolesterol (TC), LDL-C, TG, FBS och HDL-C undersöktes med hjälp av Pars Azmun (Iran) kit av Hitachi 911 (Tyskland).
2.7. Analys och tolkning av resultat
formeln användes för analys av det relativa genuttrycket hos grupper med metaboliskt syndrom och kontrollgrupper. Effektiviteten av realtids-PCR beräknades för varje gen med hjälp av 10-2 spädning; därefter placerades det erhållna antalet i följande beräkningsformel för att mäta vikförändringarna av genuttryck :SPSS V.16 programvara användes för statistisk analys med 95 % konfidensintervall. Variablernas normalfördelning kontrollerades med Kolmogorov-Smirnov-metoden och därefter jämfördes värdena mellan två grupper via independent samples -test.
3. Resultat
Demografiska egenskaper och biokemiska faktorer hos de studerade grupperna presenteras i tabell 2. Förhållandet män/kvinnor var 1/3 i varje grupp (12 M och 24 F). Som framgår av tabell 2 var skillnaderna i alla undersökta parametrar statistiskt signifikanta mellan två grupper () med undantag för ålder och LDL-C. Gruppen med metaboliskt syndrom hade högre BMI, LDL-C, TC, TG, FBS, diastoliskt/diastoliskt blodtryck och midjeomfång jämfört med friska individer, medan HDL-C var signifikant lägre i gruppen med metaboliskt syndrom.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BMI: Body Mass Index; FBS: Fast Blood Sugar; TG: triglycerid, HDL-C: high density lipoprotein-cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein-cholesterol; signifikant skillnad. |
3.1. Resultat av qRT-PCR
Efter avslutad PCR-reaktion verifierades resultaten genom analys av reaktionskurvan, produkternas smältkurva och elektrofores av PCR-produkterna. Elektroforesen kördes på 1 % agaros med hjälp av en 100 bp DNA-ledare. Resultaten visas i figur 1.
3.2. Utvärdering av genuttryck i PBMC
Uttrycksnivåerna för generna mättes i de mononukleära cellerna i det perifera blodet och jämfördes mellan två grupper genom beräkning av ΔCT för varje gen. Det fanns ingen skillnad i ABCA1-uttrycket mellan de två grupperna men ABCG1-uttrycket var signifikant lägre i MetS-gruppen (). De detaljerade resultaten visas i tabell 3.
|
||||||||||||||||||||||||||
Signifikant. |
Också beräkningen av vikförändring i ABCG1-uttrycket () visade på 3,1 gånger lägre uttryck i MetS-gruppen.
4. Diskussion
ABCA1 och ABCG1 har en avgörande roll i den omvända transporten av kolesterol från perifera vävnader såsom makrofager till levern . ABCA1- och ABCG1-genernas uttryck har dock studerats vid vissa sjukdomar; Vi har inte hittat någon rapport om detta ämne i samband med metaboliskt syndrom. I den här studien undersökte vi uttrycket av dessa gener hos personer med metaboliskt syndrom och friska individer.
Men medan det inte fanns någon signifikant skillnad i ABCA1-genuttrycket mellan de två undersökta grupperna, fann vi ett signifikant lägre uttryck (ca 75 %) av ABCG1 hos personer med metaboliskt syndrom jämfört med kontrollgruppen. Singaraja et al. visade att det minskade ABCA1 i makrofager och njurar är förknippat med ökat kolesterolinnehåll . De drog slutsatsen att försämrad ABCA1-medierad kolesterolexport kan bidra till ökad ateroskleros och nefropati i samband med diabetes . I vissa rapporter försöker man ta upp de möjliga mekanismer som reglerar uttrycket av dessa gener. Nyligen har det visats att polymorfismer i ABCA1 och ABCC8 kan vara förknippade med metaboliskt syndrom . Det finns bevis som visar att störningar i ABCA1-funktionen, som kan vara resultatet av en mutation i denna gen, kan leda till familjär hypoalipoproteinemi som kännetecknas av låg HDL-halt och ökad deponering av kolesterylestrar i flera vävnader och celler . Det har också visats att överuttryck av ABCA1-genen kan ge skydd mot ateroskleros . Dessa uppgifter stämmer överens med våra resultat och stöder idén att ett lägre uttryck av ABCA1-genen kan bidra till komplikationer i samband med det metabola syndromet.
Haghpassand et al. visade att ABCA1-genuttrycket i PBMC:s har ett direkt samband med kolesterolbelastningen, och att överuttryck av ABCA1 leder till att det överflödiga kolesterolet överförs till apoproteinerna . Wang et al. studerade den omvända kolesteroltransporten i ABCA1- och ABCG1-nedsläckta möss och drog slutsatsen att när både ABCA1 och ABCG1 slogs ned, så är den omvända kolesteroltransporten större jämfört med ABCG1-nedsläckt .
Då Mauerer et al. påpekade att den höga glukosnivån (hyperglykemi) är inblandad i minskat ABCA1- och ABCG1-uttryck in vitro , förefaller det logiskt att förvänta sig liknande förändringar i MetS . Promotorer av ABCA1 och ABCG1 har receptorplats för LXR och RXR; när oxykolesterol och retinsyra förenas med dessa faktorer ökar uttrycket av ABCA1 och ABCG1. Dessutom är cAMP och NFκB transkriptionsfaktorer för ABCA1 respektive ABCG1.
De erhållna resultaten visade på en signifikant minskning av ABCG1-uttrycket hos patienter med metaboliskt syndrom jämfört med friska individer. Dessa resultat tyder på att hyperglykemi, relaterade metaboliter och hyperlipidemi över transportörkapaciteten kan leda till minskat uttryck av ABCG1. Eftersom ingen signifikant förändring observerades i ABCA1-genuttrycket kan det bero på en annan regleringsmekanism. Eftersom strukturerna för dessa gener är olika och de regleras av olika transkriptionsfaktorer kan våra resultat motiveras . Det begränsade antalet prover i denna studie är dock en annan faktor för avsaknaden av förändringar i ABCA1-uttrycket.
Den andra punkten är att vi undersökte uttrycket av dessa gener i PBMC hos de studerade personerna; det är viktigt att notera att förändringarna i uttrycket av dessa gener i monocyter kan skilja sig från förändringarna i de andra viktiga vävnaderna, såsom lever och tarm, som är de viktigaste platserna för HDL-syntesen. Dessutom innebär förändringar i mRNA-nivåer inte nödvändigtvis förändringar i det relaterade proteinet.
Interessentkonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna uppsats är hämtad från Zahra Tavoosis magisteruppsats. Författarna vill tacka Hamadan University of Medical Sciences för finansiellt stöd till denna studie.