Proteinexpression, rening och analysförfaranden för hAASS-SDH
Vektor: pFB-LIC-Bse
Cellinje: DH10Bac
Tags och tillägg: N-terminal, TEV-proteas klyvbar hexahistidin-tagg
Konstruera proteinsekvensen:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(den understrukna sekvensen innehåller vektorkodad His-tag och TEV proteas klyvningsställe*)
Harvade celler resuspenderades i lysisbuffert (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 20 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL per 1 mL proteashämmare cocktail EDTA-fri).
Cellpellpelletsen löstes upp i cirka 200 mL lysisbuffert och bröts genom homogenisering genom två passeringar vid 12 000 psi. Cellresterna pelleterades vid 35000 x g, 1 timme och supernatanten användes för rening på en Ni-NTA-kolonn med gravitationsflöde (5 mL).
De buffertar som användes beskrivs nedan;
Bindningsbuffert: Binding Buffer: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 20 mM Imidazole pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Wash Buffer: Används för att binda buffert: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 40 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Elutionsbuffert: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 40 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 % glycerol, 250 mM imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Det förtydligade celextraktet tillsattes till 5 ml Ni-NTA-harts som förekvibrerats med lysisbuffert och passerade genom en glaskolonn. Kolonnen tvättades sedan med bindningsbuffert (2 x 50 ml) och tvättbuffert (2 x 50 ml). Proteinet eluerades med Elution Buffer i 5 x 5 mL fraktioner. De eluerade fraktionerna från kolonn 1 sammanfördes och koncentrerades till 5 mL med en 30 kDa MWCO-spinnkoncentrator och injicerades i en S200 16/60-kolonn (förekvilibrerad i GF-buffert (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % glycerol)) vid 1,0 mL/min. 1,5 mL-fraktioner samlades upp. Det eluerade proteinet klyvdes över natten vid 4 °C med TEV-proteas (1/20 (w/w)). Följande dag laddades proteinprovet på en 0,5 ml Ni-sefaros-kolonn som förekvilibrerats med GF-buffert för att avlägsna icke-klyvda proteiner. Poolade proteinfraktioner koncentrerades till 13 mg/mL med hjälp av en 30 kDa mwco-koncentrator.
Aktivitetsanalys och screening
Den SDH-aktivitet av hAASS mättes genom att följa NAD+-reduktionen till NADH, med utnyttjande av att den reducerade formen av NADH är fluorescerande när den exciteras med 340 nm ljus. Vi antog analysen i 384-brunnsformat, med detektion med hjälp av PheraStar fluorescensläsare (BMG Labtech) (Excitation/Emission = 340/480 nm). Denna analys gav ett linjärt svar med en proteinkoncentration på upp till 150 nM. En typisk reaktion består av 100 nM renat enzym, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM saccharopin. Reaktionsbufferten består av 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA, 0,05 % CHAPS. Föreningsbiblioteken (LOPAC (Sigma) och NIH Clinical Collections I&II) screenades internt vid 20 μM föreningskoncentration.
Differential scanning fluorimetry
DSF utfördes i en 96-brunnsplatta med hjälp av en Mx3005p RT-PCR-maskin (Stratagene) med excitations- och emissionsfilter på 492 respektive 610 nm. Varje brunn bestod av 2 µL protein i 2 µM DSF-buffert (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE utspädd 1000 gånger i DSF-buffert från tillverkarens lager (Invitrogen) och (i förekommande fall) 2 µL ligand i olika koncentrationer. Fluorescensintensiteten mättes från 25 till 96 °C med en ramphastighet på 3 °C/min.
Kristallisering
Apo-kristaller framställdes genom att blanda 50 nL hAASS-SDH-protein (80 mg/mL) med 100 nL reservoarlösning som innehåller 20 % PEG3350, 0,1 M Tris pH 7,5 och 0,2-0,33 M natriummalonat. NAD+-bundna kristaller framställdes genom att blanda 100 nL hAASS-SDH (18 mg/mL, i molärt överskott av NAD+) med 50 nL reservoarlösning innehållande 25 % PEG3350, 0,2 M NaCl och 0,1 M tris pH 8,5. Kristallerna kryoskyddades i 9 % butandiol innan de frystes in i flytande kväve. För fragmentscreeningkampanjen blötlades kristallerna med föreningar (10/50/500 mM) i kristalliseringslösningen kompletterad med 8 % butandiol i 5-30 minuter och frystes in i flytande kväve.
Strukturbestämningsförfaranden
hAASS-SDH apo- och NAD+-bundna kristaller tillhör olika rymdgrupper (P43212 vs P212121). Strukturen hos hAASS-SDH löstes genom molekylär ersättning med programmet PHASER, med svampens saccharopinreduktas från S.cerevisiae (PDB-kod 2AXQ) som sökmodell (38 % sekvensidentitet). Två molekyler hittades i den asymmetriska enheten (a.u.). Den ursprungliga modellen byggdes om med hjälp av phenix.autobuild. En bunden NAD+-molekyl i den aktiva platsen identifierades med hjälp av difference Fourier-metoden och placerades manuellt i elektrontätheten med hjälp av Coot. För att slutföra modellen utfördes iterativa cykler av phenix.refine inklusive TLS-förädling följt av manuell modelluppbyggnad för saknade rester med hjälp av Coot. Inga NCS-begränsningar tillämpades på grund av konformationsskillnader i domän III (res 278-376) i de två kopiorna i a.u. Lösningsmedelsatomer placerades under de fyra sista förädlingsrundorna med hjälp av phenix.refine. För fragmentscreeningkampanjen identifierades ligander med DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) med hjälp av differenstäthetskartor. Svagare bindemedel med låg beläggning utvärderades med hjälp av PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), baserat på statistiska modeller för att hitta ligandtäthet som finns i ett visst dataset och som inte finns i majoriteten av dataseten. Koordinater och strukturfaktorer för alla dataset är deponerade i RCSB Protein Data Bank. Statistik om datainsamling och förädling finns tillgänglig på PDB-sidorna.
Kommersiellt tillgängliga reagenser
CRISPR/Cas9 knockout plasmider
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Cat # 10157