Isolering och karakterisering av föroreningar i 8-khloroteofyllin

Motsvarande författare: S. Y. GABHE E-post:

Abstract

En enkel isokratisk omvänd fas med högpresterande vätskekromatografi användes för att separera tre föroreningar som fanns i provet av 8-klorotheofyllin. LC-MS användes för att karaktärisera föroreningarna. Baserat på masspektrala data karakteriserades strukturerna hos dessa föroreningar som 3,7-dihydro-1,3-dimetyl-1H-purin-2,6-dion (förorening I), 3,7-dihydro-1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6-dion (förorening II) och isomer av 8-klor-1,3-dimetyl-2,6(3H,1H)-purinedion (förorening III).

Nyckelord

8-kloroteofyllin, förorening, LC-MS, reversed phase HPLC, teofyllin

Introduktion

Bulkläkemedelsindustrin utgör basen för alla läkemedelsindustrier, eftersom den är källan till aktiva farmaceutiska substanser (API) av specificerad kvalitet. Den stora utmaningen för bulkläkemedelsindustrin är att på ett ekonomiskt sätt framställa det färdiga läkemedlet av erforderlig kvalitet och renhet. De aktiva substansernas renhet beror på flera faktorer, t.ex. råvaror, deras tillverkningsmetoder och typ av kristalliserings- eller reningsprocess. Det är dock nästan omöjligt att få fram absolut rena material, eftersom föroreningar införlivas i dem antingen under tillverkning, rening eller lagring. En förorening är varje komponent i en läkemedelssubstans (utom vatten) som inte är en kemisk enhet som definieras som läkemedelssubstans. När det gäller läkemedelssubstanser som framställs genom kemisk syntes klassificerar ICH föroreningar i tre kategorier: organiska föroreningar, oorganiska föroreningar och rester av lösningsmedel. De föroreningar som finns i substansen kan vara giftiga och kan förändra substansens fysiska eller kemiska egenskaper, vilket gör den medicinskt oanvändbar. Orenheterna kan minska produktens hållbarhet och orsaka svårigheter i formuleringen. Därför är inte bara kontroll av föroreningar utan även kvalificering av föroreningar en kritisk fråga för industrin för bulkläkemedel.

Antihistaminer som dimenhydrinat och promethazintheoklat är allmänt använda läkemedel för behandling av rörelsesjuka. 8-klorotheofyllin, kemiskt 8-chlor-1,3-dimetyl-2,6(1H, 3H)-purinedion, är en mellanprodukt som används vid framställning av saltformen av dessa läkemedel. Det är viktigt att säkerställa renhet och säkerhet för dimenhydrinat och promethazintheoklat. För att uppnå detta måste 8-klorotheofyllin erhållas med högsta renhet och med en känd föroreningsprofil.

Från litteraturöversikten framgår att Wadke et al. studerade interaktionerna mellan 9-metylisoalloxazin och 3,9-dimetylisoalloxazin och 8-klorotheofyllin. 8-klorotheofyllin användes som intern standard för bestämning av urat med HPLC-metoden. Det bestämdes också potentiometriskt. Samtidig bestämning av klorfenoxaminhydroklorid, 8-klorotheofyllin och koffein i flerkomponentsdoseringsform utfördes med en tunnskiktskromatografi-densitometrisk metod. Gil et al. undersökte det elektroanalytiska beteendet hos 8-klorotheofyllin med cyklisk voltametri och differentiell pulspolarografi och bestämde dess innehåll i farmaceutiska preparat med differentiell pulspolarografi. En stabilitetsindikerande RP-HPLC-metod utvecklades och validerades för 8-klorotheofyllin tillsammans med difenhydramin och koffein. Förhållande-spektrospektroskopiska, noll-korsande första derivativa spektrofotometriska och kemometriska metoder utvecklades också för samtidig bestämning av koffein, 8-klorotheofyllin och klorfenoxaminhydroklorid i ternära blandningar. Hittills har ingen kromatografisk och spektroskopisk metod rapporterats för separation och karakterisering av föroreningar i 8-klorotheofyllin. Därför har detta arbete genomförts i syfte att isolera och karakterisera föroreningar i 8-klorotheofyllin med hjälp av moderna analytiska tekniker.

8-klorotheofyllin var ett gåvoprov från Kores (India) Ltd., Thane. Alla andra kemikalier och reagenser anskaffades från S. D. Fine Chemicals Ltd (Mumbai, Indien). De lösningsmedel som användes för TLC-studier och förberedande TLC-studier var av analytisk kvalitet och de som användes för HPLC-studier var av HPLC-kvalitet. Natriumacetat trihydrat av AR-kvalitet användes för beredning av buffert.

Inledningsvis utfördes TLC-studier för att känna till antalet föroreningar som fanns i provet. Förbelagda TLC-plattor av kiselgel 60GF254 (Merck) användes som stationär fas. Provet löstes i en minimal mängd etylacetat och denna lösning användes för att färga TLC-plattorna. Olika rörliga faser provades. Etylacetat:toluen:isättika (10:0,3:0,5 v/v/v/v) visade bättre separation jämfört med andra rörliga faser. Fyra komponenter separerades från provet av 8-klorotheofyllin med hjälp av TLC med Rf-värdena 0,029, 0,132, 0,198 respektive 0,852. 8-kloroteofyllin hade ett Rf-värde på 0,852.

När den mobila fasen för TLC hade utvecklats gjordes ett försök att separera blandningen med hjälp av preparativ TLC. Provet löstes i en minimal mängd etylacetat och drogs ut i form av ett band. Alla tre föroreningar separerades från 8-klorotheofyllin genom preparativ TLC med samma kromatografiska förhållanden som användes i TLC-studierna. De olika banden samlades in separat och extraherades med etylacetat. Eftersom mängderna av varje isolerad förorening I, II och III var mycket små beslutades det att dessa föroreningar skulle isoleras tillsammans. Förorening I, II och III betecknades gemensamt som fraktion I. Fraktion I isolerades från 8-klorotheofyllin genom preparativ TLC. Eftersom varje förorening inte isolerades separat kunde olika identifieringstekniker som IR och NMR inte användas. Det beslutades att ytterligare undersökningar skulle utföras med hjälp av LC-MS, som möjliggör samtidig separation och karakterisering. Före LC-MS-analysen utvecklades en HPLC-profil för fraktion I. En Tosoh högpresterande vätskekromatograf utrustad med en kolvpump CCPM, en pumpregulator PX8010 och en UV-detektor användes för HPLC-studier. En slinga med en kapacitet på 20 µl monterades på injektionsventilen. Fraktion I löstes i acetonitril och utsattes för HPLC-analys i omvänd fas med mobil fas bestående av acetonitril: natriumacetat trihydrat (pH 3,57; 0,01 M) (5:95 v/v). Den valda kolonnen var Phenomenex ODS (250×4,6 mm I.D.; partikelstorlek 5 µm). Flödeshastigheten var 1,5 ml/min och detektionen övervakades vid en våglängd på 280 nm. Den rörliga fasen filtrerades genom G5-filter av sintrat glas under vakuum före användning och sonicerades för att avlägsna luftbubblor. HPLC-analysen av fraktion I visade också tre toppar med genomsnittliga retentionstider på 8,324 min, 14,275 min respektive 20,933 min (fig. 1). Toppen med en genomsnittlig retentionstid på 2,086 min var lösningsmedelstoppen.

Fraktion I genomgick sedan en LC-MS-analys för att karakterisera föroreningar. LC-MS-studierna utfördes på ett system där LC-delen bestod av HPLC i 1100-serien (Agilent Technologies, USA) som består av en vakuumavgasare (G1322A), en kvartärpump (G1311A), en automatisk provtagare (G1313A) och en UV/synlig detektor (G1314A) och MS-delen bestod av en trippelkvadrupol-masspektrometer Quattro II (Micromass UK Ltd.),

I LC-MS-studier uppnåddes vätskekromatografiska separationer med Phenomenex C18-kolonn (250×4,6 mm, 5 µm) vid rumstemperatur med den rörliga fasen acetonitril: natriumacetatbuffert (5:95, v/v) vid en flödeshastighet på 1,5 ml/min. Masspektrometern kördes i positivt elektronsprayjoniseringsläge (ESI) med mass/laddningsförhållande (m/z) i intervallet 120-500 m/z. Kväve användes som nebulisatorgas. Data insamlades och bearbetades med Masslynx-programvaran. Masspektraldata för föroreningarna erhölls (fig. 2, 3 och 4). Fragmenteringsvägen för tre toppar kännetecknas av förlust av metylgrupp och/eller karbonylgrupp. Toppar med m/z-värdena 180,9, 195,7 och 214,9 motsvarar +-, +- respektive +-toppar. Enligt de erhållna MS-dataen var den förorening som eluerades vid 8,324 min, 14,275 min och 20,933 min teofyllin (molvikt 180), koffein (molvikt 194) respektive en isomer av 8-klorotheofyllin (molvikt 214,5) (tabell 1). Således separerades tre föroreningar och deras strukturer klargjordes på grundval av masspektraldata (schema 1).

TABELL 1: HPLC-MS IDENTIFIERING AV FRAKTION I

Acknowledgements

Författarna är tacksamma mot Kores (India) Ltd., Thane för att ha tillhandahållit presentprov av 8-klorotheofyllin.

1. Kasture AV, Wadodkar SG, Mahadik KR, More HV. Läkemedelsanalys. Vol. 1. Pune: NiraliPrakashan; 1997. s. 12-4.
2. United State Pharmacopoeia, Vol. 26. Rockville, MD: United States Pharmacopoeia Convention, Inc. 1999. s. 2049-59.
3. Ahuja S, Alsante KM. Handbook of isolation and characterization of impurities in pharmaceuticals. California: Academic Press; 2003. s. 6.
4. Foye WO, Lemke TL, Williams DA. Principles of Medicinal Chemistry. 4th ed. New Delhi: B. I. Waverly Pvt Ltd; 1995. s. 419.
5. Reynolds JE. Martindale-The Extra Pharmacopoeia. 29th ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. s. 451,459.
6. Wadke DA, Guttman DE. Komplexbildningens inverkan på reaktionshastigheten III. Interaktion mellan vissa isoalloxaziner och 8-klorotheofyllin som bestäms av spektrala, löslighets- och kinetiska metoder. J Pharm Sci 1965;54:1293.
7. Bennett MJ, Patchett BP, Worthy E. En enkel HPLC-metod för bestämning av urat i serum och urin med 8-klorotheofyllin som intern standard. Med Lab Sci 1984;41:108-11.
8. Nikolic K, Medenica M. Potentiometrisk bestämning av 8-klorotheofyllin. Microchimica Acta 1986;88:5.
9. Bebawy LI, El-Kousy NM. Simultanbestämning av vissa flerkomponentsdoseringsformer genom kvantitativ densitometrisk metod med tunnskiktskromatografi. J Pharm Biomed Anal 1999;20:663-70.
10. Gil EP, Blazquez LC, Garcia-MoncoCarra RM, Misiego AS. Polarografiskt beteende hos 8-khloroteofyllin och dess bestämning i doseringsformer. Electroanalysis 1993;5:343.
11. Barbas C, Garcia A, Saavedra L, Castro M. Optimering och validering av en metod för bestämning av koffein, 8-klorotheofyllin och difenhydramin med isokratisk högpresterande vätskekromatografi. J ChromatogrA 2000;870:97-103.
12. Kelani KM. Simultanbestämning av koffein, 8-kloroteofyllin och klorfenoxaminhydroklorid i ternära blandningar med kvotspektrospektrofilometriska och kemometriska metoder med nollkorsning av första derivativa spektrofotometriska och kemometriska metoder. J AOAC Int 2005;88:1126-34.