Abstract
Bakgrund. Proteinet ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) är en peroxisomal halvtransporter som möjliggör nedbrytning av mycket långkedjiga fettsyror (VLCFA). Patogena varianter av ABCD1 leder till att VLCFA:er ansamlas i olika vävnader och kroppsvätskor, vilket resulterar i en sjukdom som kallas X-bunden adrenoleukodystrofi (X-ALD). Denna sjukdom kännetecknas oftast av binjurebarksinsufficiens och hög VLCFA-koncentration och har varierande nivåer av neurologisk inblandning beroende på fenotyp. Exempelvis har den Addison-ena formen av X-ALD ingen neurologisk påverkan, medan den cerebrala formen av X-ALD ofta orsakar allvarlig sensorisk förlust, motorisk funktionsnedsättning, kognitiv försämring och död. Metoder. En nyligen karakteriserad och misstänkt patogen variant i ABCD1 analyserades med hjälp av vår proteininformatiska plattform (PIP). Personliga molekylära studier på proteinnivå genomfördes på genetiska testdata, vilket kompletterade analysen och den kliniska studien. Resultat. Ett fall av adrenomyeloneuropati (AMN) i vuxen ålder och en ny ABCD1-variant presenteras. Det unika ABCD1-proteinet diskuteras och probandens fall jämförs med befintliga rapporter om AMN. Slutsatser. Datafusion från flera källor kombinerades i ett omfattande tillvägagångssätt som gav en berikad bedömning av patientens sjukdom och prognos. Molekylär modellering utfördes på varianten för att bättre karakterisera dess kliniska betydelse och bekräfta patogeniciteten.
1. Introduktion
Proteinet ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (ABCD1) är en del av superfamiljen ATP-binding cassette transporter, som består av transmembranproteiner som ansvarar för att överföra lipider, metaboliter och andra molekyler mellan celler eller intracellulära strukturer. Det kodas av ABCD1, en gen som ligger på Xq28 . ABCD1 är en peroxisomal halvtransportör som importerar mycket långkedjiga fettsyror (VLCFA) till peroxisomen genom att binda ATP. Dysfunktionell ABCD1 kan inte flytta VLCFA:er till peroxisomen för att brytas ned, vilket resulterar i ackumulering av VLCFA:er i kroppsvätskor och vävnader . Denna onormala nivå av VLCFAs fungerar som en karakteristisk biomarkör för X-bunden adrenoleukodystrofi (X-ALD), den vanligaste peroxisomala sjukdomen . X-ALD är ett genetiskt tillstånd som främst är förknippat med demyelinisering, neurodegeneration och binjurebarksinsufficiens . Över 800 varianter har rapporterats inom ABCD1-genen . Trots detta har tydliga genotyp-fenotypkorrelationer inte observerats .
Hemizygota män uppvisar vanligtvis de mest betydande symptomen, medan heterozygota kvinnor ofta utvecklar en mindre grad av funktionsnedsättning senare i livet . De tre klassiska fenotyperna är enbart Addisons sjukdom, adrenomyeloneuropati (AMN) och cerebral ALD. Individer med enbart Addison-sjukdomen uppvisar vanligen binjurebarksinsufficiens mellan 2 och 7 års ålder. Neurologisk degeneration förekommer inte initialt, men utvecklas ofta i takt med att individen åldras. AMN börjar vanligtvis under det tredje till fjärde levnadsåret och påverkar främst ryggmärgen . Det första kliniska kännetecknet är ofta progressiv stelhet och svaghet i benen. Binjureinsufficiens förekommer hos ungefär 2/3 av AMN-patienterna, och cerebrala förändringar drabbar ungefär hälften av dem . Cerebral ALD är den allvarligaste fenotypen, där cerebral demyelinisering orsakar snabb försämring av hörsel, syn, motorik och kognition . Denna variant av X-ALD, som oftast förekommer hos barn och ungdomar, leder ofta till döden inom 2-4 år efter det att symtomen uppvisats.
Denna rapport beskriver historien för en försöksperson som i trettioårsåldern diagnostiserades med AMN. Molekylär analys av ABCD1-genen identifierade en variant av osäker betydelse hos denna individ. Intressant nog har denna variant rapporterats patogen i ALD Mutation Database, men information om det kliniska fallet har inte publicerats. Vår probands kliniska fall inkluderas för att bättre stödja patogeniciteten hos denna ABCD1-variant. Protein informatics platform (PIP) användes för omfattande molekylär modellering för att ytterligare karakterisera betydelsen av denna variant och klargöra till probandens diagnos.
2. Fallstudie (klinisk beskrivning)
Probandens var en 31-årig man som presenterades för utvärdering av ett progressivt neurologiskt tillstånd. Symtomen på detta tillstånd uppträdde först för 2 år sedan när proband började snubbla allt oftare. Han skulle senare uppleva generaliserad muskelsvaghet och stelhet tillsammans med ytterligare gångdysfunktion. För att motverka detta hade den undersökte mannen under de senaste sju månaderna använt en rullator för att underlätta ambuleringen. Han hade också utvecklat urininkontinens. Dessutom rapporterade han hjärndimma, minnesförlust, uppmärksamhetsstörningar, ångest och trötthet. Grundläggande mentala uppgifter tog längre tid att utföra som en följd av detta. Enligt den prövade personen förvärrade alkoholanvändning dessa brister. Slutligen förlorade den undersökta personen 20 pund sedan hans tillstånd började och kunde inte återfå sin vikt trots samordnade ansträngningar för att göra det. Denna viktnedgång berodde delvis på symtom på illamående och kräkningar, som var vanligast på morgonen.
Under den fysiska undersökningen kunde den prövade inte resa sig från en sittande position utan att använda sina händer. Mild ataktisk dysartri identifierades. Visuella fixeringstester visade på sällsynta fyrkantiga ryckningar. Glatt strävan var saccadisk och han uppvisade långsamma, fullständiga saccader både vertikalt och horisontellt. Sträckreflexerna var patologiskt snabba i de övre extremiteterna. Den prövade mannen hade också patologiskt snabba mitotiska sträckreflexer i de nedre extremiteterna, inklusive ihållande klonus vid fotlederna. Det fanns en måttligt nedsatt proprioception i de stora tårna. Mild svaghet i övre motorneuronfördelningen sågs i de nedre extremiteterna med sparande av iliopsoas. Testning från häl till skänkel visade på dyssynergi. När han gick omkring tittade han på sina fötter och rörde sig med ett reducerat steg. Knäna var hyperextenderade, han tenderade att gå på tå och ibland gled han med fötterna. Romberg-tecken fanns. När han stod upp fanns det darrande rörelser i benen, främst i quadriceps. Den provade personen vände sig 360 grader under tre försök, vilket krävde 9 till 15 steg per vändning. Hans posturala reflexer var onormala, och ”Pull”-testet var -3.
MRI av hjärnan var normal, och MRT av halsryggen visade fynd som tyder på mild, diffus ryggmärgsatrofi. Det fanns inga tecken på subakut kombinerad degeneration eller annan förvärvad ryggmärgssjukdom (figur 1). Han hade behandlats för borrelia, eftersom hans IgM-titrar för borrelia var positiva, men ingen signifikant förbättring hade registrerats. Hans cerebrospinalvätska beskrevs som acellulär. Utvärdering av hiv, HTLV1, hepatit C, hepatit B och cytomegalovirus var negativ. Familjehistoria med liknande symtom kunde inte fastställas, eftersom probandens kunskap om deras sjukdomshistoria var begränsad (figur 2).
Probandens peroxisomala fettsyraprofil erhölls efter de tidigare testerna och avbildningarna. Onormala koncentrationer av C26 : 0, C24/C22 och C26/C22 förekom, vilket tydde på hemizygositet för X-bunden adrenomyeloneuropati. Adrenokortikotropt hormon uppmättes till 528 pg/mL (RR: 7,2-63). Därefter genomfördes sekvensering och deletions-/duplikationsanalys av ABCD1-genen. Den prövande mannen var hemizygot för en variant av osäker betydelse i ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Denna variant fanns inte i ExAC:s onlinedatabas, även om den förtecknades som patogen i ALD Mutation Database. Två liknande varianter, c.1596A>G (p.Lys533Glu) och c.1598A>G (p.Lys533Arg), har också tidigare rapporterats som kliniskt betydelsefulla .
3. Metoder
3.1. Strukturell modellering
Sekvensen av mänsklig ATP-bindande kassett underfamilj D medlem 1 (känd som ABCD1) är sannolikt ett transportprotein, som har en nukleotidbindande region med en veckning som kan fungera som en ATP-bindande underenhet med ATPasaktivitet. Det är känt att korrekt dimerisering krävs för att bilda en aktiv transportör. ABCD1 är en medlem av ALD-subfamiljen som deltar i peroxisomal fettsyraimport till organeller. Dessa peroxisomala ABC-transportörer är ”halvtransportörer”, vilket innebär att de kräver en partnerhalvtransportörmolekyl – den funktionella formen är alltid homodimär eller heterodimär. ABCD1 antas vara nyckeln till peroxisomal transport eller katabolism av mycket långkedjiga fettsyror. ABCD1 är känd för att interagera med PEX19 och kodas av ABCD1-genen, som togs från NCBI Reference Accession Sequence: NP_000024: version NP_000024.2, som kodas för aminosyrasekvensen, och användes för datorstödd modellering. Monte Carlo-simuleringar utfördes på mutanten för att möjliggöra lokala regionala förändringar för 745 aminosyror i full längd.
Röntgenförfiningen för Monte Carlo byggdes upp med hjälp av YASARA SSP/PSSM-metoden . Strukturen relaxerades till kraftfältet YASARA/Amber med hjälp av kunskapsbaserade potentialer inom YASARA. Sidokedjorna och rotamrarna justerades med kunskapsbaserade potentialer, simulerad glödgning med explicit lösningsmedel och små ekvilibreringssimuleringar med hjälp av YASARA:s raffineringsprotokoll . Hela strukturen i sin fulla längd modellerades och eventuella luckor eller olösta delar från röntgenstrålen fylldes i.
Förfining av de färdiga modellerna genomfördes antingen med hjälp av Schrodinger’s LC-MOD Monte Carlo-baserade modul eller med hjälp av NAMD2-protokollen. Dessa förfiningar började med YASARA-genererade inledande förfiningar och varianter . Överlagring och efterföljande förfining av de överlappande områdena ger en fullständig modell för ABCD1. De slutliga strukturerna utsattes för energioptimering med PR-konjugerad gradient med ett R-beroende dielektricum.
Atomkonsistensen kontrollerades för alla 745 aminosyror (12 201 atomer) i den fullständiga vildtypmodellen (WT) och 745 aminosyror (12 221 atomer) för varianten, genom att verifiera riktigheten av kedjebeteckning, dihedraler, vinklar, vridningar, torsioner, icke-bindningar, elektrostatik, atomtyper och parametrar. En dimermodell förutsägs, som består av 24 402 atomer inklusive kofaktorer och joner. Varje modell exporterades till följande format: Maestro (MAE) och YASARA (PDB). Modellmanipulering gjordes med Maestro (Macromodel, version 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010) eller Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analyser betonades på N-terminus-regionen som innehåller de första 350 aminosyrorna med tanke på längden och C-term-avståndet från mutationsplatsen.
Monte Carlo-dynamik-sökning (hybrid MC eller via förbättrad MDS-provtagning) genomfördes på varje modell för konformationsprovtagning, med hjälp av metoder som tidigare beskrivits i litteraturen . I korthet minimerades varje ABCD1-variantsystem med avslappnade begränsningar med hjälp av antingen Steepest Descent eller Conjugate Gradient PR och fick sedan genomgå MC-sökningskriterierna, enligt vad som anges i litteraturen . Det primära syftet med MC, i detta scenario, är att undersöka eventuell konformationsvariabilitet som kan uppstå med olika mutationer i regionen nära mutationen och den möjliga effekten på DNA-bindning eller bearbetning med ABCD1.
4. Resultat
4.1. Struktur- och funktionsstudier
För WT jämfört med varianten p.K533E fann vi att objektets stabilitet från energetiska beräkningar för ΔG per aminosyra förblir relativt lika, så att WT har en objektstabilitet på 114,67 kcal/mol∗Å2. Varianten p.K533E orsakar en nettoökning av den fria energin med 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, vilket kan vara destabiliserande för den lokala regionen . Denna objekts stabilitet var positiv vilket indikerar att vissa dynamiska förändringar är troliga med en molekylär simulering för konformationsprovtagning. Således undersökte vi de lokala resterna och fastställde att en elektrostatisk beräkning kan vara användbar för att förklara förändringen i funktionen. Den molekylära modellen för den fullständiga strukturen och dess variantform ges (figur 3(a)) med hjälp av våra senaste metoder, som har etablerats . Den dimeriska modellen är kritisk för funktionen och visar viktiga interaktioner vid mutationsstället som störs av variantmutationen.
Lokala rester inom 12 Å avgränsning nära variantplatsen (p.K533E) inkluderar rester från båda monomerer. Den monomer som innehåller varianten (monomer 1, grå karboner) har följande närliggande rester med position 533-interaktioner: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 och K624 (figur 3(b)). Denna variantstruktur (p.Lys533Glu) analyserades och en mer direkt störning av den lokala miljön indikerades från den positiva lysinladdningen (+) som vändes till en negativ glutaminsyra (-) som var ganska störande för de intilliggande laddade resterna (ovan). Särskilt resterna K624, E499 och Y532 är placerade i olika interaktioner (figur 3(b)). Lokalt ΔG per aminosyra ökar ett positivt nettovärde som motsvarar ogynnsam stabilitet i fickan och längre dynamik skulle krävas för att bestämma den totala effekten men kan förväntas vara destabiliserande. K533E-restigen har intressanta interaktioner med Q472, I474, I475 och E499. K533E befinner sig i en helix-helix-region där dess laddade sidokedja är placerad utåt mot motsatt laddade arter; det finns också en viss helix-helix-interaktion med de intilliggande helixerna (figurerna 3(b) och 3(c)). Samma rester är inblandade i varianten, men positionen har ändrats för flera av resterna, inklusive P534, P535 och K624 (figur 3(c)). Denna interaktion kan förklara den förändrade funktionen på grund av förändrat dynamiskt beteende för den lokala strukturella stabiliteten (figur 3(c)). Elektrostatiska beräkningar genomfördes för ytterligare analys (figur 4). Framför allt placeras resterna K624, E499 och Y532 i olika interaktioner (figur 3(b)). Lokalt ΔG per aminosyra ökar ett positivt nettovärde som motsvarar ogynnsam stabilitet i fickan och längre dynamik skulle krävas för att bestämma den totala effekten men kan förväntas vara destabiliserande.
4.2. Dimerbildningseffekter
Mappning av elektrostatik genomfördes med hjälp av Poisson-Boltzmann-beräkningen för solvation på hela strukturen med 745 aminosyror. Effekterna av förändringarna var starkt uttalade på den elektrostatiska fördelningen med en +3 KT/E cutoff för båda. WT-partikeln (alla 745 aa) visar en tydlig laddningsfördelning runt K533, som visar få negativt laddade områden och stora neutrala fickor på grund av de rika hydrofoba resterna som finns i de ovan nämnda spiralerna. Treoninmutationen tycks ändra fördelningen av laddningarna och placerar positionen för de negativa laddningarna längre bort från varandra samtidigt som storleken på de neutralt laddade regionerna ökar (figurerna 4(a) och 4(b)). Den lokala regionen p.K533E är laddad för att matcha den positiva lysinrestigen med intilliggande glutaminsyrarester (inom 6 Å) (figur 4(b)). Omvänt har rest K533 positiva laddningar som påverkas av rester inom 6 Å, nämligen E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 och K624 (figur 4(a)) . Varianten p.K533E verkar inte ha någon effekt på själva dimeren (figurerna 3 och 4), eftersom varianten är distal till gränssnittet mellan monomererna. Det finns dock en betydande störning i den lokala närheten där lysinet är naturligt infogat i en ficka med sina närliggande rester som är motsatt laddade och engagerar sig i H-bindningar och saltbrygginteraktioner, vilket går förlorat med den negativa laddningen från glutaminsyrasubstitutionen (figur 3).
5. Diskussion
För patienter med AMN är alternativen för behandling för närvarande begränsade. Nyligen genomförd forskning med musmodeller utgör dock en potentiell lösning. Hos X-ALD-patienter åtföljs uppbyggnaden av VLCFAs av ökade nivåer av radikala syrearter. Dessa radikaler driver på sjukdomsutvecklingen, skadar vävnaden och orsakar i slutändan neurologiska symtom. Möss med X-ALD-analoger har framgångsrikt behandlats med en blandning av antioxidanter, vilket har fått radikalnivåerna under kontroll och stoppat denna patogena process . Om senare försök fortsätter att visa sig lovande, är det möjligt att vår försöksperson och andra AMN-patienter en dag skulle kunna behandlas på ett liknande sätt.
Och även om vår försöksperson uppvisade en dåligt förstådd variant i ABCD1, skilde sig hans fall inte nämnvärt från den typiska AMN-fenotypen. Symtomen började i slutet av tjugoårsåldern, vilket passar väl in i det förväntade åldersintervallet 20-40 år. AMN har typiskt sett ryggmärgsinflammation, något som bekräftades av probandens MRT-undersökningar. Hans bensvaghet och gångmissbildningar är karakteristiska för sjukdomen, liksom urininkontinens. Kräkningar och illamående är förknippade med binjurebarksinsufficiens, medan den prövade mannens tal och mentala avvikelser kan vara förknippade med cerebrala förändringar . Trots detta måste det sägas att en patient som har samma ABCD1-variant som vår försöksperson kan uppvisa olika symtom. Patogena varianter i ABCD1 resulterar sällan i förutsägbara fenotyper – även när en identisk version finns hos familjemedlemmar .
Proteininformatiken som härrör från de statistiska mekanikberäkningar som tillämpats på den molekylära modelleringen för varianterna jämfört med vildtypen ger oss tydliga indikationer på dysfunktion av det normala proteinbeteendet på en molekylär nivå som skulle påverka funktionen. Vi fann till exempel att variant p.K533E orsakar en nettoökning av den fria energin med 2,321 kcal/aamolÅ2, vilket destabiliserar den lokala regionen inom 12 Å från rest K533. På grund av den lokala strukturella förändringen som mildras genom ryggradrester och sekundärstrukturella interaktionsförändringar (H-bindningsnätverket visas inte) tillåter korrelerad rörelse att fortplanta sig i hela strukturen vilket ytterligare frustrerar den korrekta bildningen av dimern.
På grund av sällsyntheten hos vår probands ABCD1-variant kunde det kommersiella laboratoriet inte säkert namnge varianten som patogen. Dessutom gjorde logistiska utmaningar och den probandens lilla familjestorlek att familjesegregationsanalyser var opraktiska. Därför kunde denna process inte slutföras för att hjälpa oss att bättre förstå betydelsen av hans variant. Tack och lov gav molekylär modellering oss en ny möjlighet. Molekylär proteinmodellering stödde misstankarna om att denna variant skulle påverka proteinfunktionen på ett kliniskt betydelsefullt sätt. Det var utan misstanke att denna variant inte skulle ha klassificerats som patogen med tanke på den grova förändringen av strukturen, vilket stöddes starkt av PIP-analysen.
6. Slutsats
Slutningsvis rapporterar vi en proband med en sällsynt variant i ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Bristen på information om denna variant hindrade gentestföretaget från att klassificera hans variant som patogen, men de molekylära laddningarna verkar tyda på att denna region av proteinet är avsevärt störd från jämvikten (figur 3(b)). Utnyttjande av proteinmodelleringen gav också information som kunde införlivas i probandens större kliniska bild. Dessutom finns ett exempel på denna variants patogenicitet förtecknat i ALD Mutation Database. Sammantaget möjliggjorde dessa bevis en säker diagnos av AMN. Vår försöksperson hade typiska symtom på AMN, men den fenotypiska variabilitet som är inneboende i ABCD1 kan resultera i en annan X-ALD-presentation för andra individer som har denna variant.
Abkortningar
| ABCD1: | ATP-binding cassette, subfamily D, member 1 (gene) |
| VLCFA: | Very long chain fatty acids |
| X-ALD: | X-linked adrenoleukodystrophy |
| AMN: | Adrenomyeloneuropati. |
Data Tillgänglighet
Datasatser och material är detaljerade i manuskriptet.
Samtycke
Alla förfaranden som följdes var i enlighet med de etiska normerna för den ansvariga kommittén för experiment med människor (institutionell och nationell) och med Helsingforsdeklarationen från 1975, reviderad 2000 (5). Informerat samtycke inhämtades från alla patienter för att ingå i studien.
Intressekonflikter
Alla författare förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Författarnas bidrag
Alla författare ovan har lämnat väsentliga bidrag till utformningen eller designen av arbetet; eller till förvärv, analys eller tolkning av data för arbetet OCH utarbetandet av arbetet eller kritiskt reviderat det för viktigt intellektuellt samtycke OCH gett slutligt godkännande av den version som ska publiceras OCH gått med på att ansvara för alla aspekter av arbetet genom att se till att frågor relaterade till noggrannheten eller integriteten av någon del av arbetet undersöks och löses på lämpligt sätt.
Finansiering
Finansiering tillhandahölls av Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic som tillhandahöll medel för att genomföra den här studien.
Acknowledgment
TC tackar Center for Individualized Medicine vid Mayo Clinic Jacksonville för forskningsstöd.