Och även om proteinanalyser har många olika användningsområden inom biovetenskaplig forskning finns det ingen enskild analysmetod som är lämplig för alla tillämpningar. Trots alla framsteg inom den moderna vetenskapen finns det ingen proteinanalysmetod som inte påverkas av icke-proteinkomponenter eller av skillnader i proteinsammansättning. Av denna anledning anser proteinlaboratorier att det är nödvändigt att ha mer än en typ av proteinanalys för forskningstillämpningar.
Varje analysmetod har sina egna fördelar och begränsningar. Om du vill få exakta resultat från ditt experiment bör du därför kunna välja den lämpligaste analysen för din tillämpning.
Typer av kolorimetriska proteinanalyser
Baserat på den inblandade kemin är de två vanligaste metoderna för kolorimetrisk detektion och kvantifiering av totalprotein proteinbindningsanalys och/eller kopparjonbaserad chelatanalys.
Färgämnesbindningsanalyser
Färgämnesbindningsanalyser, t.ex. Bradford- (Coomassie) och 660nm-proteinanalyser, bygger på bindning av proteinmolekyler till Coomassie-färgämnet under sura förhållanden. När proteinmolekylerna binder till färgämnet skiftar färgen från brunt (Amax= 465nm) till blått (Amax= 610nm). Förändringen i färgtäthet (som avläses vid 595nm) är proportionell mot proteinkoncentrationen.
De basiska aminosyrorna (arginin, lysin och histidin) spelar en avgörande roll för bildandet av färgämnesproteinkomplex och den resulterande spektralförskjutningen, medan mindre proteiner (mindre än 3kDa) och aminosyror inte ger upphov till färgförändringar.
Kopparjonbaserade analyser
I kopparjonbaserade proteinanalyser blandas proteinlösningen med en alkalisk lösning av kopparsalt för att underlätta kopparjonernas (Cu2+) kelering med peptidbindningarna och den efterföljande reduktionen av kopparjonerna (Cu2+) till kopparjoner (Cu+). Eventuella överskott av kopparjoner förblir obundna till peptidbindningarna och är tillgängliga för detektion.
Proteinanalyser baserade på kopparjoner kan delas in i två grupper – (1) analyser som detekterar reducerade kopparjoner (Cu+) och (2) analyser som detekterar obundna kopparjoner (Cu2+). Bicinchoninsyra (BCA) eller Folin-reagens (fosfomolybdic/fosfotungstiksyra) kan användas för att påvisa kopparjoner. Vid reduktion av det använda reagenset bildas en blå färg. Mängden producerad färg kan avläsas vid 650nm till 750nm och är proportionell mot mängden peptidbindningar.
Anmärkning: Närvaron av tyrosin, tryptofan, cystein, histidin och asparginin i protein ökar den resulterande färgtätheten.
I analyser som baseras på detektion av obundna kopparjoner blandas alkalisk koppar med proteinlösningen och de obundna kopparjonerna detekteras sedan med ett färgproducerande reagens som reagerar med kopparjoner. Mängden färg som produceras är omvänt proportionell mot mängden peptidbindning i provet.
Välja proteinanalyser: Några faktorer att beakta
Det finns ett antal faktorer som du bör beakta när du väljer en analys. Här är några av dem.
- Kompatibilitet med provtyp och komponenter. Proteinprovets beskaffenhet och närvaron av icke-proteinämnen i proteinlösningar kan avsevärt påverka resultaten av ditt experiment. Tänk på att närvaron av reduktionsmedel, metallkeleateringsmedel, färgämnen, aminer och sockerarter stör kopparbaserade proteinanalyser medan proteinlösningar som innehåller tvättmedel stör de färgämnesbaserade proteinanalyserna.
- Analysområde och erforderlig provvolym. De flesta kolorimetriska analyser kräver minst 0,5 µg protein för en tillförlitlig uppskattning. För svårtillgängliga prover bör man därför överväga metoder som kräver minsta möjliga provmängd för en tillförlitlig uppskattning.
- Protein-till-protein-uniformitet. Färgämnesbaserade proteinanalyser och sådana som innebär reduktion av kopparjoner till kopparjoner har en betydande protein-till-protein-variation.
- Tidsmässiga överväganden. Provets komplexitet och den valda analysmetoden dikterar hur mycket tid du behöver för att utföra din proteinanalys. Proteinprover som innehåller störande ämnen och analyser som använder standardplottar eller kurvor tar mer tid i anspråk.
- Krav på instrumentering. Tillgången till den spektrofotometer eller plattläsare som behövs för att mäta den färg som produceras (absorbans) av analysen kan också påverka ditt val.
