3D-utskrivna bioniska öron | CDhistory

Design och implementering av bioniska organ och anordningar som förbättrar människans förmågor, så kallad cybernetik, har varit ett område av ökande vetenskapligt intresse.1,2 Detta område har potential att generera skräddarsydda ersättningsdelar för människokroppen, eller till och med skapa organ som har förmågor som ligger bortom det som mänsklig biologi normalt tillhandahåller. Särskilt utvecklingen av metoder för direkt multidimensionell integrering av funktionella elektroniska komponenter med biologiska vävnader och organ skulle kunna få en enorm betydelse för regenerativ medicin, proteser och gränssnitt mellan människa och maskin.3,4 Nyligen har flera rapporter beskrivit kopplingen mellan elektronik och vävnader med hjälp av flexibla och/eller sträckbara plana enheter och sensorer som anpassar sig till vävnadsytor, vilket möjliggör tillämpningar som biokemisk avkänning och undersökning av elektrisk aktivitet på hjärtats,5 lungor,6 hjärna,7 hud8 och tänder.9 Det är dock betydligt svårare att uppnå sömlösa tredimensionellt sammanfogade elektroniska komponenter med biologiska vävnader och organ.4

Vävnadsteknik styrs av principen att en mängd olika celltyper kan förmås att syntetisera ny vävnad om de sås ut på en lämplig tredimensionell hydrogelställning i en lämplig tillväxtmiljö.10-15 Efter odling in vivo eller in vitro bildas vävnadsstrukturer som har samma morfologi som den ursprungliga ställningen.16 En stor utmaning i traditionella vävnadstekniska metoder är dock att generera cellutsådda implantat med strukturer som efterliknar den ursprungliga vävnaden, både när det gäller anatomiska geometrier och cellfördelningar inom vävnaden.17 Tekniker som utsäde av celler i icke-klevande formar eller självuppvikande ställningar har använts för att tillverka tredimensionella vävnadskonstruktioner med komplexa 3D-geometrier.18,19 De befintliga teknikerna är dock fortfarande oförmögna att på ett enkelt sätt skapa organ- eller vävnadsdelar med den rumsliga heterogenitet och de exakta anatomiska geometrier som krävs för att möta bristen på donatororgan för transplantation.20-22 Till exempel är en total rekonstruktion av det yttre örat med autogent brosk – med målet att återskapa ett öra som liknar det kontralaterala öronhinnan i utseendet – fortfarande ett av de svåraste problemen inom området för plastikkirurgi och rekonstruktiv kirurgi.23

Additiv tillverkningsteknik som 3D-utskrift erbjuder en potentiell lösning via möjligheten att snabbt skapa CAD-modeller (Computer-aided design) genom att skära upp dem i lager och bygga lagren uppåt med hjälp av biologiska celler som bläck, i exakta anatomiska geometrier av mänskliga organ.24-27 Variationer av 3D-utskrift har använts som metoder för tillverkning av fasta friformer, även om användningen huvudsakligen har begränsats till skapandet av passiva mekaniska delar.24,28 Extruderingsbaserad 3D-utskrift har använts för att konstruera hårdvävnadsställningar, t.ex. knämenisker och intervertebrala skivor, som är kompletta med inkapslade celler.29-31 Denna teknik ger möjlighet att skapa rumsligt heterogena multimaterialstrukturer genom att använda deponeringsverktyg som kan extrudera ett brett spektrum av material.32 Vidare möjliggör funktionella byggstenar i nanoskala en mångsidig montering nedifrån och upp av komponenter i makroskala som har justerbara funktioner. Detta skulle kunna möjliggöra samtidig utskrift av nanoelektroniska material och biologiska celler för att ge tredimensionellt integrerade cyborgvävnader och organ med unika egenskaper.33,34

Här presenterar vi ett konceptuellt nytt tillvägagångssätt som tar itu med de ovannämnda utmaningarna genom att helt väva samman funktionella elektroniska komponenter med biologisk vävnad genom 3D-utskrift av nanoelektroniska material och livskraftiga cellutsådda hydrogeler i de exakta anatomiska geometrierna hos mänskliga organ. Eftersom elektroniska kretsar är kärnan i anordningar för sensorik och informationsbehandling35 , möjliggör in vitro-odling av den utskrivna hybridarkitekturen tillväxt av ”cyborgorgan” som uppvisar förbättrade funktioner jämfört med mänsklig biologi. Vår metod ger möjlighet att definiera och skapa rumsligt heterogena konstruktioner genom att extrudera ett brett utbud av material i en lager för lager-process tills den slutliga stereolitografiska geometrin är klar. Konceptet med 3D-utskrift av levande celler tillsammans med elektroniska komponenter och odling av dem till funktionella organ utgör en ny inriktning för sammansmältning av elektronik och biologiska system. Sådana cyborgorgan skiljer sig från vare sig konstruerad vävnad eller konform planar/flexibel elektronik och erbjuder ett unikt sätt att uppnå en tredimensionell sammanslagning av elektronik och vävnad.

Som ett bevis på detta tillvägagångssätt har vi utvärderat 3D-utskriftens förmåga att skapa en livskraftig öronöronhåla som också innehåller elektronik som möjliggör alternativa funktioner till den mänskliga hörseln. Mänskliga organ som huvudsakligen består av broskvävnad, t.ex. öronörat, är lämpliga prototypkandidater för att undersöka genomförbarheten av vårt tillvägagångssätt. Detta beror på 1) den inneboende komplexiteten i örats anatomiska geometri, vilket gör det svårt att bioteknikera med traditionella vävnadstekniska metoder, samt 2) enkelheten i dess struktur på broskvävnadsnivå på grund av avsaknaden av blodkärl.23,36 Dessutom ger bottom-up montering av nanoelektroniska matriser möjlighet att hierarkiskt generera funktionella elektroniska komponenter i makroskala. Vi demonstrerar 3D-utskrift av en alginathydrogelmatris med alginatfrön från kondrocyter med en elektriskt ledande induktiv spoleantenn med silvernanopartiklar (AgNP), som är ansluten till cochlea-formade elektroder med stöd av silikon. Sammantaget är resultatet en tredimensionell integrering av funktionella elektroniska komponenter i det mänskliga örats komplexa och exakta anatomiska geometri (fig. 1).

Följande steg ingår i processen. Först används en CAD-ritning av det bioniska örat (fig. 1A) för att föreskriva den anatomiska geometrin och den rumsliga heterogeniteten hos de olika funktionsmaterialen. Som beskrivits ovan består de tre funktionella beståndsdelarna (strukturella, biologiska och elektroniska) i det bioniska örat av tre material. Dessa material matas in i en sprututrusionsbaserad Fab@Home 3D-skrivare (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (fig. 1B). Den utskrivna bioelektroniska hybridöronkonstruktionen odlas sedan in vitro för att möjliggöra tillväxt av broskvävnad för att bilda ett cyborgöra med förmåga att känna av elektromagnetiska signaler i radiofrekvensområdet (RF) med hjälp av en induktiv spole som fungerar som en mottagarantenn (figur 1C).

För att demonstrera vårt tillvägagångssätt skrev vi ut den bioniska öronkonstruktionen på följande sätt. För ställningen försåg vi en alginathydrogelmatris med livskraftiga kondrocyter med en densitet på ~60 miljoner celler/mL (se stödinformation). Alginatmatrisen är tredimensionellt stabil i kultur, icke-toxisk, kompatibel med förutsättning och extrudering och ett lämpligt cellleveransmedel eftersom tvärbindning kan inledas före deponering.37 De kondrocyter som användes för utskriften isolerades från ledbrosket från en månad gamla kalvar (Astarte Biologics, Redmond, WA). En CAD-ritning av en mänsklig öronöra i stereolitografiformat (STL) med en integrerad cirkulär spoleantenn som är ansluten till cochleaformade elektroder användes för att definiera utskriftsbanorna genom att skära upp modellen i lager av kontur- och rasterfyllningsbanor. Tvärbindning inleddes i alginathydrogelmatrisen som försåtts med livskraftiga kondrocyter, som sedan 3D-printades tillsammans med ledande (AgNP-infunderad) och icke-ledande silikonlösningar (film 1). Tillsammans producerade denna metod de biologiska, elektroniska och strukturella komponenterna i det bioniska organet i en enda process.

Figur 2A visar det 3D-utskrivna bioniska örat omedelbart efter utskrift. Det visar sig särskilt att det är en trogen reproduktion av CAD-ritningen, i den exakta spatialitet för varje material som dikterades av designen. Den utskrivna öronkonstruktionen sänktes ner i ett kondrocytodlingsmedium som innehöll 10 % eller 20 % fetalt bovint serum (FBS), vilket uppdaterades var 1-2:e dag (se stödjande information). Hybridörat visade god strukturell integritet och formbevarande under odling (fig. 2B). Med tiden blev konstruktionen gradvis mer ogenomskinlig; detta var tydligast efter fyra veckors odling och är grovt sett förenligt med utvecklingen av en extracellulär matris (ECM). Det bioniska örats grova morfologi efter 10 veckors in vitro-odling visas i stödinformationen.

Viabiliteten testades omedelbart före och under de olika stegen i utskriftsprocessen. Cellernas initiala livsduglighet bestämdes efter odling med hjälp av en Trypan blue cell exclusion assay (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) och visade sig vara 96,4 ± 1,7 % (fig. 2C) (se stödjande information). Det tryckta alginatöratörat med cellfrö som trycktes ut testades också med en LIVE/DEAD® Viability Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) och uppvisade en cellviabilitet på 91,3 ± 3,9 % med en homogen fördelning av kondrocyter. Detta resultat tyder på att utskriftsprocessen, inklusive inkapsling och deponering av celler, inte märkbart påverkar kondrocyternas livskraft.

Noterbart är att detta tillvägagångssätt med att skriva ut en försådd hydrogelmatris eliminerar de stora problem som är förknippade med begränsningar av sådddjupet och ojämn sådd i traditionella metoder för sådd av förformade 3D-ställningar. Genom att sådd av kondrocyter i en bioabsorberbar alginatmatris och forma den via 3D-utskrift lokaliseras cellerna till en önskad geometri, vilket möjliggör ny ECM-produktion på definierade platser när de odlas i näringsrika medier. När vävnaden utvecklas återabsorberas polymerställningen (fig. 2D), så att den nya vävnaden behåller formen på den polymer i vilken cellerna såddes. Den biologiskt nedbrytbara ställningen ger varje cell bättre tillgång till näringsämnen och effektivare avfallshantering.

Nästan användes histologisk utvärdering för att jämföra morfologin hos kondrocyterna i neokbrosket i det bioniska örat med morfologin hos den ursprungliga broskvävnaden. Färgning med hematoxylin och eosin (H&E) visade en jämn fördelning av kondrocyterna i konstruktionerna (fig. 2E) (se stödjande information). Histologi av öronvävnaden med Safranin O-färgning visade på en relativt jämn ackumulering av proteoglykaner i den odlade öronvävnaden (fig. 2F). Dessa biokemiska data stämmer överens med utvecklingen av nytt brosk.38 Slutligen användes fluorescensmätningar för att fastställa livskraften hos den 3D-printade bioniska öronvävnaden efter 10 veckors in vitro-odlingskultur med hjälp av fluoresceindiacetat- (FDA) och propidiumjodid- (PI) färgningar. Figurerna 2G och 2H visar vävnaden som täcker spolantennen respektive den inre vävnad som är i kontakt med elektroden som löper vinkelrätt genom vävnaden. I båda fallen uppvisade det odlade brosket utmärkt morfologi och livskraft på vävnadsnivå. Noterbart är att detta tillvägagångssätt att odla vävnad i närvaro av abiotiska elektroniska material skulle kunna minimera den odlade vävnadens immunsvar.

Vi karakteriserade sedan de mekaniska egenskaperna hos brosket i olika stadier av tillväxten, eftersom ECM-utvecklingen korrelerar starkt med den utvecklade vävnadens mekaniska egenskaper.39 Först utfördes omfattande biokemiska och histologiska karakteriseringar. Prover togs ut från kulturer innehållande 10 % och 20 % FBS vid 2, 4, 6, 8 och 10 veckor och frystes in för att mäta DNA-innehållet i neokbrosket och för biokemisk utvärdering av ECM (se stödjande information). ECM-ackumulering i konstruktionerna utvärderades genom att kvantifiera mängden av två viktiga ECM-komponenter: 1) hydroxiprolin (HYP) som en markör för kollageninnehållet och 2) sulfaterad glykosaminoglykan (GAG) som en markör för proteoglykaner. Vid vecka 10 ökade HYP-innehållet till 1,2 ± 0,1 μg/mg och 1,4 ± 0,2 μg/mg för kulturer som innehöll 10 % respektive 20 % FBS (fig. 3A). Motsvarande värden för GAG-innehållet för vecka 10 var 10,6 ± 0,6 μg/mg och 12,2 ± 1,0 μg/mg (fig. 3B). Denna ökning av GAG- och HYP-innehållet tyder på att kondrocyterna är levande och metaboliskt aktiva i kulturen.

Nästan analyserades dragegenskaperna genom att testa 3D-printade chondrocyt-alginatprover av hundben vid olika kulturpunkter, där hundbenen innehöll samma celltätheter och identiska odlingsförhållanden som örat (se stödinformation). Utvärdering av de mekaniska egenskaperna visade att hundbenens Young-modul ökade med tiden från 14,16 kPa till 111,46 kPa vid vecka 10 (fig. 3C). Hundben med en lägre kondrocyttäthet på 20 miljoner celler/mL testades också under liknande förhållanden för att förstå effekten av den initiala kondrocyttätheten på de mekaniska egenskaperna hos den odlade vävnaden. Dessa visade sig ha en lägre Young-modul på 73,26 kPa vid vecka 10. Därefter karakteriserades hårdheten hos den odlade broskvävnaden i den 3D-printade aurikeln med hjälp av nanoindentationsmätningar. Intrycken utfördes på de olika anatomiska platserna i aurikeln (fig. 3D). Som framgår av tabell 1 visade sig dessa hårdhetsvärden vara relativt enhetliga, från 38,50 kPa till 46,80 kPa, vilket bekräftar den strukturella integriteten hos det utskrivna örat.40

För att demonstrera de förbättrade funktionerna hos det 3D-printade bioniska örat utförde vi en serie elektriska karakteriseringar. Först mättes spolantennens resistivitet med hjälp av fyrapunktssondmätningar och visade sig vara beroende av den volymetriska flödeshastighet som användes för att skriva ut det ledande AgNP-infunderade silikonet (se stödjande information). Vid den optimala flödeshastigheten visade sig den tryckta spolens resistivitet vara 1,31 × 10-6 Ω-m, vilket bara är två storleksordningar högre än rent silver (1,59 × 10-8 Ω-m). Därefter utförde vi experiment med trådlös mottagning av radiofrekvenser. För att visa att det bioniska örat kan ta emot signaler bortom normala hörbara signalfrekvenser (hos människor, 20 Hz till 20 kHz) bildade vi externa anslutningar till de cochlea-formade elektroderna som utgår från det bioniska örats induktiva spole (figur 4A). Örat utsattes sedan för sinusvågor med frekvenser från 1 MHz till 5 GHz. Spolantennens S21-parameter (forward transmission coefficient) analyserades med hjälp av en nätverksanalysator och visade sig överföra signaler över detta utvidgade frekvensspektrum (figur 4B).

Som ett demonstrationsexempel på mångsidigheten i att modifiera det färdiga organet genom att ändra CAD-konstruktionen tryckte vi ut ett kompletterande vänster öra genom att helt enkelt reflektera originalmodellen (se stödjande information). Vänster och höger kanal av stereofoniskt ljud exponerades för det vänstra och högra bioniska örat via sändande magnetiska loopantenner med ferritkärnor (fig. 4C). De signaler som togs emot av de bioniska öronen samlades in från signalutgången från de dubbla cochlea-formade elektroderna och matades in i ett digitalt oscilloskop och spelades upp av en högtalare för auditiv och visuell övervakning. Utdrag av de överförda och mottagna signalerna med en varaktighet på 1 ms för både det högra och det vänstra bioniska örat visas i figur 4D och visar en utmärkt återgivning av ljudsignalen. Den uppspelade musiken (Beethovens ”Für Elise”) från signalen som mottogs av de bioniska öronen hade god ljudkvalitet (film 2).

Sammanfattningsvis tillverkades designade ”cyborg-öron” som kan ta emot elektromagnetiska signaler inom ett omfattande frekvensområde från Hz till GHz. Vår strategi utgör ett principbevis för att kombinera mångsidigheten hos additiva tillverkningstekniker med nanopartikelsammansättning och vävnadstekniska koncept. Resultatet är generering av verkliga bioniska organ i både form och funktion, vilket bekräftas av vävnadstekniska riktmärken och elektriska mätningar. Sådana hybrider skiljer sig från vare sig konstruerade vävnader eller plana/flexibla elektronikelement och erbjuder ett unikt sätt att uppnå en sömlös integrering av elektronik och vävnader för att generera cyborgorgan ”från hyllan”. Slutligen kan användningen av 3D-utskrift med andra klasser av funktionella byggstenar i nanoskala, inklusive halvledar-, magnetiska, plasmoniska och ferroelektriska nanopartiklar, utvidga möjligheterna att konstruera bioniska vävnader och organ.