Det okulära svaret på en intrakammarinjektion
Det har föreslagits att de F4/80+ monocytära cellerna som är centrala för induktionen av ACAID var residenta iris- och ciliarkroppsceller som emigrerade från iris via Schlemm’s kanal1,6,10 till cirkulationen. Eftersom antigenet finns i ögat i minst 24 timmar kan antigenet ha en ”depå”-effekt även om en del antigen finns i cirkulationen snabbt efter den intrakammarala injektionen av antigenet8. Eftersom den intrakammarala injektionen av antigenet inducerar uppkomsten av ACAID-inducerande PBMC är det troligt att det är dessa monocytära celler, snarare än enbart det cirkulerande antigenet, som inducerar ACAID.
En intravitreal injektion av antigen inducerar en infiltration av monocytära celler till näthinnan som ett tidigt skede av uveit.11,12 Dessutom inducerar okulär infektion ett starkt inflammatoriskt infiltrat i den bakre eller främre kammaren.12-14 I överensstämmelse med en sådan inflammation sker en ökning av inflammatoriska cytokiner i okulära vätskor, t.ex. kammarvätskan. Följaktligen inducerar en intrakammarinjektion av partikulärt antigen en ökning av mRNA för TNF-α, vilket tyder på ett tidigt inflammatoriskt svar i främre kammaren.14,15 Dessutom induceras inte det systemiska undertrycket av fördröjd typ av överkänslighet hos möss som får en intrakammarinjektion av antikroppar mot TNF-α tillsammans med antigenet, vilket tyder på att TNF-α krävs under induktionen av ACAID. Dessutom var induktionen av ACAID i dessa undersökningar beroende av vilken storlek på nålen som användes för den intrakammarala injektionen av lösliga proteiner och om antigenet var i partikelform eller löslig form.15 Dessa författare föreslog att den intrakammarala injektionen av partikelformiga antigener och/eller storleken på den nål som används för intrakammarala injektioner inducerar ett trauma som krävs för att inducera ACAID. Makrofager och dendriformceller som uttrycker den dendritiska cellmarkören CD11c är bosatta i iris, ciliarkroppen och aorta i det främre segmentet.8,10,16,17 Antigen som injiceras i den främre kammaren tas snabbt upp av dessa celler. Dessutom finns makrofager och dendriformceller nära Schlemm’s kanal17,18 som tros vara platsen där F4/80+ celler från främre kammaren går ut i cirkulationen.1 Det har dock ifrågasatts om de celler som finns i iris och som absorberar antigenet går ut i cirkulationen.16 Lösligt antigen lämnar snabbt främre kammaren via cirkulationen och distribueras på samma sätt som intravenöst antigen.8 En del av det antigen som lämnar ögat kan vara i tolerogen form.19 Det är dock troligt att det intrakammarala antigenet presenteras i thymus och mjälte av så kallade ”tolerogena antigenpresenterande celler” som lämnade ögat med antigen. Dessutom inducerar TGF-β i kammarvattnet eller producerat av iris F4/80+-celler en suppressiv fenotyp i perifera F4/80+-celler10,20,21 vilket tyder på att induktionen av en suppressiv fenotyp i F4/80+-celler sker i främre kammaren.
I likhet med behandlingen av perifera F4/80+-celler med kammarvatten och antigen, medför inkubation av F4/80+-celler från peritoneal exsudat med antigen och TGF-β in vitro att cellerna åläggs en suppressiv fenotyp. När dessa celler injiceras iv i naiva möss inducerar de antigenspecifika spleniska regulatoriska T-celler som liknar den som erhålls genom intrakammarisk injektion av antigen.21 ACAID induceras av mycket få F4/80+-celler som behandlas på detta sätt1 vilket tyder på att (omätbara) celler som emigrerar från iris och ciliarkroppen kan inducera ACAID. Dessutom inducerar F4/80+ irisceller som återvinns från möss som fått en intrakammarinjektion av antigen inducerar ACAID eller ger F4/80+ PBMC en suppressiv fenotyp som liknar de cirkulerande celler som återvinns från möss som fått en intrakammarinjektion av antigen9,21 . Det är troligt att antigen som tas upp och bearbetas av antigenpresenterande celler i iris kan överföras till de PBMC som infiltrerar främre kammaren på samma sätt som antigen överförs till ACAID-inducerande B-celler i mjälten av TGF-β-behandlade, antigenbärande peritoneala exudatceller.22 Sammantaget tyder dessa observationer på att händelser som inträffar i den främre kammaren skulle kunna inducera en suppressiv fenotyp på icke-residenta inflammatoriska celler som infiltrerade den främre kammaren.
Med utgångspunkt i ovanstående överväganden undersökte vi möjligheten att den intrakammarala injektionen av antigen inducerar ett inflöde av cirkulerande PBMC till den främre kammaren på grund av injektionstraumat. Dessa infiltrerade celler skulle utsättas för immunosuppressivt TGF-β i kammarvattnet och residenta iris/ciliarkroppens dendriformceller som skulle kunna presentera det injicerade antigenet för de infiltrerade PBMC. I enlighet med denna hypotes rekryteras de celler som rekryterats till främre kammaren på grund av den skada som orsakats av injektionen och återcirkulerar sedan till thymus och mjälte där de inducerar regulatoriska T-celler.
Inom tre timmar efter den intrakammarala injektionen av ovalbumin (OVA) fann vi också en ökning av TNF-α i kammarvattnet, enligt vad som beskrivits av Ferguson et al.15 Dessutom har vi observerat en ökning av kemokinen MCP-1 i kammarvattnet sex timmar efter den intrakammarala injektionen (fig. 1). Ett nålstick utan injektion av PBS inducerade uppkomsten av TNF-α i kammarvattnet och injektionen av PBS ökade endast mängden TNF-α fem gånger mer än vad som erhölls genom ett nålstick. TNF-α i kammarvattnet minskar snabbt och påvisas inte 12 timmar efter intrakammarinjektion av ovalbumin (OVA) (data visas inte). MCP-1 bibehålls i kammarvattnet under en längre tid. Till skillnad från TNF-α uppnås dock toppnivåer av MCP-1 i kammarvattnet efter 12 timmar och kvarstår fram till 16 timmar efter intrakammarinjektion av OVA (data visas inte). Denna ökning av TNF-α- och MCP-1-nivåerna i kammarvattnet efter den intrakammarala injektionen av antigen tyder på att ett inflammatoriskt svar har inletts i den främre kammaren. Dessutom ökar inte TNF-α i kammarvattnet och ACAID induceras inte heller om nålen som används för den intrakammarala injektionen är för liten och/eller om antigenet inte är inflammatoriskt.15
Den intrakammarala injektionen av antigen förhöjer TNF-a och MCP-1 i kammarvattnet. Tre-6 timmar efter att 6-8 veckor gamla naiva BALB/c-honmöss fått iv 5 × 106 – 1 × 107 CFSE-märkta PBMC sövdes mössen med en ip-injektion av ketamin/xylazin7 och fick en intrakammaral injektion av PBS, PBS + 50 μg OVA eller en nålstickning enbart med en 24 g-nål. Sex timmar efter det att naiva möss fått en intrakammarinjektion, återfanns vattenhumör från de avlivade mössen och 10 μl analyserades med ELISA för TNF-α och MCP-1. Data representerar genomsnitt +/- S.E.M. pg upptäckta från 4-6 replikat/grupp i 2-3 experiment.
För att avgöra om det finns ett samtidigt inflöde av inflammatoriska celler i främre kammaren efter den intrakammarala injektionen av antigen, fick möss som injicerats iv med PBMC märkta med det fluorescerande färgämnet CFSE också en intrakammaral injektion. Med detta tillvägagångssätt observerade vi ett betydande inflöde av CFSE-märkta och omärkta (värd) F4/80+ monocytära celler som uttrycker kemokinreceptorerna CCR2 och CCR5, vilket visades genom att dessa celler återfanns från mössens irider 24 timmar efter det att mössen fått en intrakammarinjektion av antigen. Det fanns ingen ökning av dessa celler i kontroller som fick iv CFSE-märkta PBMC men som inte fick en intrakammarinjektion av antigen.23 Ungefär 48 timmar efter den intrakammarinjektionen av antigen minskar antalet infiltrerade celler vid iris och ökar i thymus och mjälte (fig. 2). Denna ökning av cirkulerande monocytära celler vid iris beror troligen på en infiltration av cirkulerande monocyter som svar på traumat av den intrakammarala injektionen +/- irritationsämnet PBS och/eller antigen/PBS eftersom antalet infiltrerade monocytära celler ökade när mössen fick intrakammaralt antigen: infiltration av CFSE-märkta PBMC inducerat av enbart injektion var <injektion av PBS <injektion av TNP-BSA/PBS. Monocytära celler som rekryteras till iris efter intrakammarinjektion av antigen uttrycker både CCR2 och CCR5.23 För att cellerna ska kunna vandra till iris krävs att CCR2 uttrycks, men inte CCR5, eftersom CCR2 -/- PBMC inte vandrar till iris, men CCR5 -/- PBMC vandrar till iris efter intrakammarinjektion av antigen. Dessutom inducerar intrakammarinjektion av OVA till CCR2 -/- möss inte cirkulerande monocytära celler som överför suppressionen av fördröjd typ av överkänslighet (DTH) mot OVA när de injiceras iv till mottagare av vildtyp.23
Migration av PBMC efter intrakammarinjektion. Bedövade7 BALB/c-möss fick en intrakammaral injektion av trinitrofenylerat bovint albumin sex timmar efter att mössen fått iv 5 × 106 -1 × 107 CFSE-märkta PBMC. Tjugofyra timmar efter den intrakammarala injektionen avlivades mössen genom CO2-inhalation och irider, mjälte och tymus avlägsnades, sammanfördes och enstaka cellsuspensioner framställdes. Cellerna märktes sedan med phycocyanin-anti-F4/80 och analyserades med flödescytometri. Den procentuella ökningen av CFSE, F480+ celler beräknades genom:
.