En viktig posttranslationell modifiering av histoner är acetylering av ɛ-aminogrupper på konserverade lysinrester som finns i de aminoterminala svansarna av dessa proteiner. Acetylering neutraliserar de positivt laddade lysinerna och påverkar därför histonernas interaktion med andra proteiner och/eller med DNA. Histonacetylering har länge förknippats med transkriptionellt aktivt kromatin och är också inblandad i histonavlagring under DNA-replikation (1, 2). Den första kloningen av en gen för histonacetyltransferas (HAT), genen HAT1 i jäst, rapporterades 1995 (3). Därefter föreslogs det att HAT1-proteinet är cytoplasmatiskt och involverat i histonavlagring (4), även om avsaknaden av fenotyper hos hat1-mutanter i jäst, liksom de senaste bevisen för att både de mänskliga och jäst-enzymerna är nukleära (ref. 5; S. Tafrov och R.S., opublicerat arbete), gör HAT1:s funktion in vivo oklar.
Ett stort genombrott på detta område var reningen och kloningen av HAT A, en HAT från makrokärnan hos ciliaten Tetrahymena (6). Sekvensen av HAT A visade att den liknade en känd transkriptionell koaktivator från jäst, GCN5. Sedan dess har många studier visat att GCN5 (och den besläktade P/CAF) är konserverade HAT:er vars aktivitet på nukleosomer underlättar initiering av transkription (se ref. 7). Intressant nog kan GCN5 i sig själv acetyla fria histoner (särskilt Lys-14 av H3) men inte nukleosomer. Acetylering av nukleosomer av GCN5 kräver att GCN5 befinner sig i ett av två stora proteinkomplex som kallas Ada och SAGA i jäst (8). Under de senaste åren har flera däggdjursproteiner, som inte är relaterade till GCN5 men som också är involverade i transkriptionsaktivering, visat sig ha HAT-aktivitet. Dessa inkluderar CBP/p300, TAF250, ACTR och SRC-1 (9-12). Det blir således allt tydligare att histonacetylering av nukleosomer är en viktig komponent i den flerstegs genaktiveringsprocessen.
I detta nummer av Proceedings rapporterar Trievel et al. (13) kristallstrukturen av den katalytiska HAT-domänen hos GCN5 från jäst. Denna domän omfattar rester 99-262 av det 439-aa stora proteinet. En del av deras struktur, som består av fyra antiparallella β-strängar (β1-4), följt av en α-helix (α3) och ytterligare en β-sträng (β5), visas i Fig. Fig. 1.1. Denna del av GCN5 är mycket lik i sin struktur den av jäst HAT1 (14), liksom två andra N-acetyltransferaser vars substrat inte är histoner, nämligen aminoglykosid 3-N-acetyltransferas (AAT; ref. 15) och serotonin N-acetyltransferas (16). Alla dessa enzymer tillhör en familj av proteiner som genom sekvensanalys identifierats som sådana med likheter med kända N-acetyltransferaser, t.ex. GCN5, och som därför kallas GNAT-superfamiljen (17). Medlemmarna i denna superfamilj har den gemensamma egenskapen att de överför en acetylgrupp från acetyl-CoA till en primär aminogrupp, även om det rör sig om mycket olika aminogrupper för de olika enzymerna, dvs, till ɛ-aminogrupper på lysiner när det gäller HATs, till α-aminogrupper på proteiners N-terminaler när det gäller enzymer som ARD1 eller MAK3, till sockerarter när det gäller AAT (15) och GNA1 (18, 19), eller till serotonin när det gäller serotonin-N-acetyltransferas (16). Alla medlemmar av GNAT-superfamiljen har ett bevarat motiv som kallas motiv A (visas i rött i fig. Fig. Fig.1),1), och de flesta av dem har två andra bevarade motiv som kallas B och D.
Ribbondiagram av GCN5 som visar den bevarade kärnan som återfinns i fyra N-acetyltransferaser och i ett N-myristoyltransferas. Motiv A i GNAT-superfamiljen visas i rött. Acetyl CoA som finns i HAT1 har modellerats in i GCN5-strukturen. Svaveln i acetyl CoA visas i gult.
Det förutspåddes att de konserverade motiven i GNAT superfamiljen skulle vara involverade i bindningen av acetyl CoA eftersom det är det enda substratet som dessa olika N-acetyltransferaser har gemensamt (17). Strukturen av HAT1 med bundet acetyl-CoA bekräftade faktiskt att motiv A är involverat i CoA-bindningen (14), liksom det strukturella arbetet med aminoglykosid 3-N-acetyltransferas (15) och serotonin N-acetyltransferas (20). I figur 11 har acetyl CoA modellerats in i GCN5-strukturen, baserat på dess position i HAT1 (13, 14). Acetyl CoA är bundet i en V-formad klyfta som bildas mellan β-strängarna 4 och 5. Det mycket konserverade motivet A i GNAT-familjen binder till pyrofosfatdelen av acetyl-CoA. Pantothenat- och β-merkaptoetanolamin-enheterna i CoA är orienterade längs β4 och vätebundna till den, vilket efterliknar en β-sträng.
Trievel et al. (13) föreslår en mekanism för katalysen av GCN5. De föreslår att en glutamatrest (Glu-173) är placerad så att den abstraherar en proton från en NH3+ -grupp på den lysin som ska acetyleras, så att den oladdade aminogruppen sedan kan utföra en nukleofil attack på karbonylkolet i den reaktiva thioestergruppen i acetyl CoA. Fig. 22 visar en överlagring av GCN5:s (i gult) och HAT1:s (i rött) förmodade aktiva platsområden med bundet acetyl-CoA. Återigen märker man hur strukturellt lika de två proteinerna är i denna region. Enligt Trievel et al:s förslag skulle Glu-173 i GCN5, särskilt efter omorientering av dess sidokedja, vara tillräckligt nära det inkommande lysinet för att utföra baskatalys. Mutation av Glu-173 till Gln upphäver faktiskt aktiviteten in vivo och in vitro (13). Det finns ingen Glu- eller Asp-resurs på motsvarande position i HAT1. Vi noterar dock att Glu-255 eller Asp-256 i HAT1 på den intilliggande β-strängen i klyftan är placerade så att de skulle kunna utföra samma katalytiska funktion (Fig. (Fig.2).2). Dessa rester har ännu inte muterats.
Superposition av β4-α3-β5 av GCN5 (gul) och motsvarande region av HAT1 (röd). Proteinerna representeras som Cα-spår med bundet acetyl CoA. Glu-173 i GCN5, som tros vara involverad i katalysen, visas i boll- och pinnrepresentation, liksom resterna Glu-255 och Asp-256 i HAT1.
Det framgår tydligt av strukturerna av GCN5, HAT1 och två andra medlemmar av GNAT-superfamiljen att de har en bevarad kärna, inklusive bindningsstället för acetyl-CoA (Fig. (Fig.1).1). Intressant nog har N-myristoyltransferas en liknande struktur som de N-acetyltransferaser som diskuterats ovan (21, 22), även om detta enzym överför en mycket större acylgrupp från myristoyl-CoA till α-aminogrupper av glykiner vid substratproteinernas N-ändar. Å andra sidan har kloramfenikolacetyltransferas, som acetylerar en hydroxylgrupp, inte en liknande struktur. Det verkar som om de GNAT-enzymer som acetylerar aminogrupper på en mängd olika substrat alla binder acetyl-CoA på ett mycket likartat sätt och kanske delar en liknande katalytisk mekanism. Naturligtvis skiljer sig dessa enzymer åt i de regioner som binder det substrat som ska acetyleras. När det gäller HATs blir nästa mål att bestämma en struktur med ett histon- eller peptidsubstrat bundet till enzymet.