Strukturella implikationer
Resultatet av att modifiera det cysteininnehållande muterade proteinet (K41C) med brometylamin är ett enzym som är ganska nära besläktat med RNas A av vildtyp. Ändå är värdet för kcat/Km för katalys av RNas A av K41S-etylaminocystein endast 8 % av värdet för vildtypenzym. Skillnaden mellan de två proteinerna måste ligga i skillnaderna mellan en thioetergrupp och en metylengrupp. Även om vinklarna för C-S-C-bindningar tenderar att vara mer spetsiga än för C-CH2-C-bindningar, uppvägs denna skillnad av C-S-bindningarnas större längd.3g,14 Molekylär modellering visar att de primära amingrupperna i S-etylaminocystein och lysin kan överlagras med en noggrannhet på 0,1 Å. En mer betydande skillnad mellan S-etylaminocystein och lysin är deras relativa preferens för gauche- snarare än anti-torsionsvinklar.15 Antikonformationen av CC-CC-bindningar gynnas med cirka 0,8 kcal/mol i modellföreningar.16 Den genomsnittliga K41-torsionsvinkeln är faktiskt (175 ± 3)° i komplexet av RNas A med cykliskt 2′,3′-uridinvanadat (U>v), en förmodad övergångstillståndsanalog (figur 2). Till skillnad från CC-CC-bindningar gynnas gauche-konformationen för CS-CC-bindningar med 0,05-0,20 kcal/mol.17 Molekylär modellering visar att CS-CC-bindningen för en S-etylaminocysteinrest i position 41 kan vara i gauche-konformationen utan att störa strukturen hos det ursprungliga proteinet. Således är thioetersidekedjorna i position 41 sannolikt mindre styva och utdragna än alkylsidekedjorna. Vi antar därför att katalysen av S-etylaminocysteinenzymet inte är lika effektiv som katalysen av RNas A av vildtyp på grund av den entropiska kostnaden för att fixera en thioeter i all anti-konformationen.
Struktur av den aktiva platsen för RNas A bundet till uridin 2′,3′-cykliskt vanadat. Strukturen förfinades på 2,0 Å från röntgen- och neutron diffraktionsdata som samlats in från kristaller som odlats vid pH 5,3. Fenylalanin 120:s sidokedja och uracilbasen visas inte.
Den katalytiska effektiviteten beror på längden på sidokedjan hos rest 41. RNas A-varianter som har en aminogrupp i slutet av en sidokedja som är längre än lysinets är mer aktiva katalysatorer än omodifierat K41C RNas A. Ytterligare längd tolereras alltså i den aktiva platsen. Fortfarande är enzymer där en aminogrupp i position 41 är separerad från huvudkedjan med 4 atomer mer aktiva än de som är separerade med 5 atomer. Detta resultat kan bero på den extra konformationella entropin eller ogynnsamma torsionsvinklar hos längre sidokedjor.
Ingen betydande fördel uppnås om rest 41 kan donera en andra vätebindning. Guanidino- och acetamidingrupper har potential att interagera samtidigt med mer än ett syre i en fosforylgrupp. Till exempel används en guanidinogrupp för att binda fosforylgrupper av HIV-1 Tat-proteinet18 och av konstgjorda receptorer.19 Vidare tycks ett arginin i stafylokockernas nukleas och ribonukleaserna i T1-familjen spela K41:s roll i RNas A.20 Vi har ersatt K41 med en argininrest och en S-acetamidinorest, som är en kort analog till arginin. Värdena för ΔΔG‡ för dessa enzymer är lägre än för de analoga enzymerna med endast en primär aminogrupp i sidokedjan i position 41. Således verkar en vätebindning vara tillräcklig för att åstadkomma en effektiv katalys. Detta resultat stämmer överens med det kristallina komplexet av RNas A med U>v (figur 2). Vanadylgruppen i U>v är en ungefärlig trigonal bipyramid med två icke överbryggande ekvatorialoxygener, O1V och O3V. Syre O1V accepterar en vätebindning från sidokedjan av glutamin 11 medan O3V accepterar en vätebindning från huvudkedjan av fenylalanin 120. Endast O1V är i stånd att acceptera en vätebindning från K41.
Mekanistiska implikationer. Den katalytiska roll som oftast tillskrivs K41 är att stabilisera den överflödiga negativa laddning som byggs upp på de icke-överbryggande fosforyloxygenerna under RNA-klyvningen (figur 2). Laddningsuppbyggnaden kan ske i ett pentakoordinerat övergångstillstånd (eller fosforanintermediat) när 2′-hydroxylgruppen angriper fosforen, på väg att förskjuta 5′-nukleosiden. Det har antagits att denna stabilisering sker genom coulombiska interaktioner.12c,21 Men det har också nyligen föreslagits att stabiliseringen sker genom en kort, stark vätebindning som inbegriper en partiell överföring av en proton från K41.22
De framträdande egenskaperna hos en lysinrest är dess positiva laddning och dess förmåga att donera vätebindningar. Tre av de fem halvsyntetiska enzymerna samt K41R delar dessa egenskaper. Det är inte enkelt att skilja mellan en interaktion som enbart bygger på coulombiska krafter och en som bygger på vätebindningar mellan två laddade arter. Det som följer är den enklaste förklaringen som är förenlig med uppgifterna i tabell 1.
Unskillnaden mellan vätebindningar och coulombiska krafter är tydligast ingenstans mer än i en jämförelse mellan S-etyltrimetylaminocysteinenzymet, som har en terminal positiv laddning men ingen förmåga att donera en vätebindning, och S-acetamidocysteinenzymet, som har en amid N-H för potentiell donation av vätebindningar, men som saknar en positiv laddning. Den låga katalytiska aktiviteten hos S-etyltrimetylaminocysteinenzymet talar starkt emot de coulombiska krafternas effektivitet vid stabilisering av övergångstillstånd. Allt annat lika minskar energin i en växelverkan mellan laddning och laddning endast som omvänt av avståndet. Metylgrupperna ger ett ökat avstånd mellan den positiva laddningen på sidokedjan och fosforyloxygenerna, i förhållande till avståndet i S-etylaminocysteinenzymet. Ändå är det osannolikt att detta avstånd är tillräckligt stort för att orsaka den observerade >103-faldiga minskningen av kcat/Km, särskilt eftersom de tre metylgrupperna lätt skulle kunna inrymmas i närheten av fosforyloxygenerna (figur 2).
Styrkan hos en vätebindning förväntas korrelera omvänt med pKa för den proton som doneras, eftersom vätebindning inbegriper en viss grad av protonöverföring.23 Som framgår av tabell 1 motsvarar ökningar av pKa faktiskt minskningar av ΔΔG‡ för halvsyntetiska enzymer med sidokedjor av jämförbar längd. För de halvsyntetiska enzymer där sidokedjans längd är jämförbar med lysin är korrelationen dock icke-linjär. Denna brist på linjäritet kan bero på att pKa för varje sidokedja beror på dess särskilda miljö i det ursprungliga proteinet. Lys41:s pKa har fastställts till 9,0,24 i stället för 10,6 som anges för butylammoniumjonen i tabell 1. Olika sidokedjor kan påverkas i olika grad. En annan, kanske mer betydelsefull, källa till icke-linjäritet är att laddade arter tenderar att delta i starkare vätebindningar än oladdade arter. Detta fenomen har observerats för proteiner25 såväl som för små molekyler, inklusive aminer.26 En jämförelse av halvsyntetiska enzymer med sidokedjor som är isosteriska men skiljer sig åt i formell laddning bör avslöja en sådan tendens. Till exempel i enzymerna S-acetamidinocystein och S-acetamidocystein är sidokedjorna i position 41 identiska med undantag för en av de två heteroatomer som är knutna till det terminala kolet. Ändå är skillnaden i förmågan hos dessa två isologiska sidokedjor att binda till övergångstillståndet större än vad som kan förväntas enbart på grund av deras syrahalt. Här är vätebindningen från ett laddat acetamidin 4 kcal/mol starkare än från en oladdad amid. Detta värde överensstämmer med andra data om den relativa styrkan hos laddade och oladdade vätebindningar i protein-ligandinteraktioner.21 Slutligen är det anmärkningsvärt att även om S-acetamidosidokedjan saknar formell laddning och har en relativt hög pKa, bidrar den fortfarande (om än blygsamt) till katalysen. Detta resultat ger ytterligare bevis för betydelsen för katalysen av en vätebindning som doneras av rest 41.