Pyrosekvensering är en metod för DNA-sekvensering (bestämning av ordningen på nukleotider i DNA) som bygger på principen ”sekvensering genom syntes”, där sekvenseringen utförs genom att detektera den nukleotid som inkorporerats av ett DNA-polymeras. Pyrosekvensering bygger på ljusdetektering baserad på en kedjereaktion när pyrofosfat frigörs. Därav namnet pyrosequencing.
Principen för pyrosequencing beskrevs första gången 1993 av Bertil Pettersson, Mathias Uhlen och Pål Nyren genom att kombinera fastfassekvenseringsmetoden som använder streptavidinbelagda magnetiska pärlor med rekombinant DNA-polymeras som saknar 3´till 5´exonukleasaktivitet (proof-reading) och luminescensdetektering med hjälp av enzymet firefly luciferas. En blandning av tre enzymer (DNA-polymeras, ATP-sulfurylas och firefly luciferas) och en nukleotid (dNTP) tillsätts till enkelsträngat DNA som skall sekvenseras och inkorporeringen av nukleotid följs genom mätning av det ljus som avges. Ljusets intensitet avgör om 0, 1 eller fler nukleotider har inkorporerats, vilket visar hur många komplementära nukleotider som finns på mallsträngen. Nukleotidblandningen avlägsnas innan nästa nukleotidblandning tillsätts. Denna process upprepas med var och en av de fyra nukleotiderna tills DNA-sekvensen för den enkelsträngade mallen är bestämd.
En andra lösningsbaserad metod för pyrosekvensering beskrevs 1998 av Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen och Pål Nyren. I denna alternativa metod introduceras ytterligare ett enzym apyrase för att avlägsna nukleotider som inte inkorporeras av DNA-polymeraset. Detta gjorde det möjligt att tillsätta enzymblandningen med DNA-polymeras, luciferas och apyrase i början och behålla den under hela förfarandet, vilket ger en enkel uppställning som lämpar sig för automatisering. Ett automatiserat instrument baserat på denna princip introducerades på marknaden året därpå av företaget Pyrosequencing.
En tredje mikrofluidisk variant av Pyrosequencing-metoden beskrevs 2005 av Jonathan Rothberg och medarbetare vid företaget 454 Life Sciences. Denna alternativa metod för Pyrosequencing byggde på den ursprungliga principen att fästa det DNA som ska sekvenseras på ett fast underlag och de visade att sekvenseringen kunde utföras på ett mycket parallellt sätt med hjälp av ett mikrofabricerat mikroarray. Detta möjliggjorde DNA-sekvensering med hög genomströmning och ett automatiserat instrument introducerades på marknaden. Detta blev det första nästa generations sekvenseringsinstrumentet som inledde en ny era inom genomikforskningen, med snabbt sjunkande priser för DNA-sekvensering som möjliggjorde sekvensering av hela genomet till överkomliga priser.