Recombinanta läkemedel från mikrobiella celler: en uppdatering 2015

Cellfabriker

Sedan den tidiga tiden för rekombinant DNA har den ständigt ökande förståelsen av cellfysiologi och stress, och av faktorer som är involverade i heterologt genuttryck och proteinproduktion, gjort det möjligt att använda olika levande fabriker, nämligen prokaryotiska och eukaryotiska celler, växter eller djur. Genom att använda dessa system löser rekombinant produktion problem med tillgången till källor, anses vara en biosäker och grön process och ger möjlighet att ändra aminosyrasekvenser och därmed proteinets funktion, för att bättre anpassa produkten till en önskad funktion . Det finns ett brett och växande spektrum av uttryckssystem som blir tillgängliga för produktion av rekombinanta proteiner . Escherichia coli var den vanligaste plattformen när den biofarmaceutiska sektorn växte fram på 1980-talet, och den följdes av jästen Saccharomyces cerevisiae. Båda systemen och de tillhörande genetiska metoderna uppvisar en ovanligt stor mångsidighet, vilket gör att de kan anpassas till olika produktionskrav . Trots att man till en början utforskade insektsceller som ett framgångsrikt system, särskilt för vaccinorienterade proteiner, är däggdjurscellinjer (framför allt CHO-celler) numera det dominerande djurrelaterade cellsystemet på grund av deras lämplighet för att producera bekvämt glykosylerade proteiner (fig. 1). Förmågan att utföra posttranslationella modifieringar står i kontrast till komplexa näringskrav, långsam tillväxt och bräcklighet samt relativt höga produktionstider och -kostnader. Bland många konventionella och nya cellbaserade system för proteinproduktion är bakterier, jäst och däggdjurscellinjer de vanligaste inom biofarmaci, och både prokaryotiska och eukaryotiska system utvecklas och konkurrerar ständigt för att förbättra sina egenskaper och intensifiera sin roll som plattformar för produktion av proteinläkemedel . Även om bakterier har förlorat sin tidiga ledande roll på området produceras fortfarande omkring 30 % av de saluförda bioläkemedel i detta system, vilket stöds av den ovanliga fysiologiska och genetiska manipulerbarheten hos prokaryota celler.

Det huvudsakliga syftet med utvecklingen av nya produktionsplattformar för proteiner är i själva verket att förbättra läkemedelsfunktionaliteten genom att nå en framgångsrik proteinveckning och posttranslationella modifieringar, samtidigt som man behåller den låga komplexiteten och höga flexibiliteten som är förknippad med prokaryotisk cellkultur. I detta sammanhang möjliggör grampositiva bakterier som Bacillus megaterium och Lactococcus lactis effektiv proteinsekretion i avsaknad av endotoxiska cellväggskomponenter, medan filamentösa svampar (t.ex. Trichoderma reesei), mossor (Physcomitrella patens) och protozoer (Leishmania tarentolae) främjar glykosyleringsmönster som liknar dem som finns i däggdjursproteiner, men de odlas fortfarande genom metoder som är enklare än de som krävs för däggdjursceller. Utförliga beskrivningar av nya plattformar (bakteriella och icke-bakteriella) som är särskilt inriktade på produktion av högkvalitativa proteinläkemedel finns på andra ställen. Den senaste utvecklingen av en endotoxinfri stam av E. coli och dess tillämpning för tillverkning av proteiner och proteinmaterial banar väg för en kostnadseffektiv och mångsidig produktion av proteiner avsedda för biomedicinsk användning genom att man hoppar över stegen för avlägsnande av endotoxiner, vilket ökar biosäkerheten och minskar produktionskostnaderna . Förhoppningsvis kommer alla dessa nya system snart att erbjuda förbättrade produkter i fortfarande enkla och helt kontrollerade biotillverkningsmetoder.

Trender inom proteinbioläkemedel

Närmare 400 rekombinanta proteinbaserade produkter har framgångsrikt producerats och godkänts som bioläkemedel , en term som hänvisar till terapeutiska produkter som genereras med hjälp av tekniker som involverar levande organismer . Ytterligare 1 300 proteinkandidater är under utveckling, varav cirka 50 % befinner sig i prekliniska studier och 33 % i kliniska prövningar (fig. 2). I detta sammanhang kan man förutse en ökning av antalet godkännanden under de kommande åren. Humulin, som utvecklades av Eli Lilly & Co på 70-talet, ett rekombinant humant insulin som tillverkades i bakterien E. coli , var det första bioläkemedlet som godkändes (av FDA) 1982. Andra naturliga proteiner som hormoner, cytokiner och antikroppar (Orthoclone OKT3) var bland de nio produkter som godkändes på 1980-talet (tabell 1). Numera är de terapiområden som har gynnats mest av rekombinanta bioläkemedel metaboliska sjukdomar (t.ex. diabetes typ 1, typ 2, fetma eller hypoglykemi), hematologiska sjukdomar (t.ex. njuranemi, hemofili A, blödnings- eller koagulationsstörningar) och onkologi (t.ex. melanom, bröst- eller kolorektalcancer), med 24, 18 respektive 15 % av godkännandena (figur 3). I detta avseende är onkologi en klart expanderande marknad. Under perioden 2010-2014 var 9 av 54 godkända biofarmaceutiska läkemedel antitumorala läkemedel, och cancer utgjorde den vanligaste indikationen under denna period. Om man gräver i de molekylära grunderna för bioläkemedel finns det en tydlig trend mot antikroppsbaserade produkter. Under samma period (2010-2014) var 17 av de 54 godkända proteinläkemedlen monoklonala antikroppar (31,5 %), jämfört med 11 % under perioden 1980-1989 . Dessutom är sex av de tio mest sålda proteinbioläkemedlen globalt 2014 (tabell 2) antikroppar eller proteiner som härrör från antikroppar (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Förut, biofarmaka var rekombinanta versioner av naturliga proteiner, med samma aminosyrasekvens som de respektive naturliga versionerna (med endast mindre modifieringar, ofta till följd av kloningsstrategin). Sedan 1990-talet baseras en betydande del av godkännandena på starkt modifierade former av rekombinanta proteiner. Detta nya alternativ, som bygger på protein- eller domänfusion och på trunkerade versioner, erbjuder ett brett spektrum av möjliga kombinationer för att erhålla nya bioläkemedel med olika förenade aktiviteter som inte förekommer tillsammans i naturen.

Proteinläkemedel för cancerbehandling

Onkologi är en av de terapeutiska indikationer som dominerar den bioläkemedelsmarknad som domineras av cancer som är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen. Kirurgi och strålbehandling är effektiva för att bota cancer i tidiga sjukdomsstadier; de kan dock inte utrota metastaserande sjukdom. Närvaron av mikrometastaser eller kliniskt uppenbara metastaser vid diagnosen kräver att de används i kombination med genotoxisk kemoterapi för att öka botningsgraden . Kemoterapins framgång har dock hindrats på grund av dess bristande selektivitet och specificitet, vilket innebär att toxiciteten för normala vävnader begränsar den dos som kan administreras till patienterna. Utvecklingen av bioläkemedel som kan hämma specifika molekylära mål som driver cancer (t.ex. monoklonala antikroppar anti-Her2-Trastuzumab- eller anti-VEGF-Bevacizumab-) går i denna riktning.

Av de marknadsförda proteinbaserade bioläkemedlen används nästan 24 % (94 produkter) i antitumoral terapi. De flesta av dessa produkter används i stödjande syfte i syfte att minimera biverkningarna av kemoterapi, vanligen neutropeni eller anemi (några representativa exempel visas i tabell 3). Nitton av dessa 94 produkter är verkliga antitumorala läkemedel, varav 69 % produceras i E. coli (fig. 4) och är baserade på konstruerade aminosyrasekvenser, proteinfusioner och enskilda proteindomäner (tabell 4).

Tydligt, modifierade proteinversioner är de vanligaste i cancerterapier jämfört med naturliga polypeptider. Som relevanta exempel kan nämnas att Ziv aflibercept är ett rekombinant fusionsprotein som produceras i CHO-celler och används mot kolorektalcancer. Det består av delar av var och en av Vascular Endothelial Growth Factor Receptors (VEGFR1 och VEGFR2) som fusionerats med den konstanta fraktionen (Fc) av ett humant IgG1-immunoglobulin (fig. 5). Denna konstruktion fungerar som ett lockbete genom att binda till VEGF-A, VEGF-B och placentaväxtfaktor (PlGF), som aktiverar VEGFR. Denna fälla hindrar interaktionen mellan tillväxtfaktorerna och receptorerna och hämmar VEGF-vägen som är involverad i den angiogena processen . Denileukin diftitox är ett rekombinant protein som består av två difteritoxinfragment (A och B) och humant interleukin-2 (figur 5). Difterietoxin är ett potent exotoxin som utsöndras av Corynebacterium diphteriae. På grund av sin speciella struktur kan hela komplexet, som produceras i E. coli, leverera ett cytotoxiskt medel direkt till en specifik måltavla. Det finns två huvudsakliga aktiva block vars funktion för det första är att selektivt leverera biofarmaka (IL-2) och för det andra att orsaka cytotoxicitet (toxin A och B) . Fusionsproteinet binder till IL-2-receptorn, som uttrycks i cancerceller (kutant T-celllymfom). När toxinkomponenten har internaliserats främjar den katalytiska domänen celldöd genom hämning av proteinsyntesen.

Då riktad läkemedelstillförsel för cancer är ett mycket nytt och expanderande forskningsområde, är andra icke-rekombinanta, proteinbaserade bioläkemedel också starkt representerade. Dessa inkluderar främst antikropps-läkemedelskonjugat (ADC) såsom Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine, eller nanopartikel-läkemedelskonjugat såsom nab-paclitaxel . I dessa fall fungerar proteinets motsvarighet som ett målinriktat fordon för konventionella kemiska läkemedel. Även denna metod syftar till selektiv läkemedelstillförsel till specifika målceller i syfte att öka den antitumorala aktiviteten och samtidigt minska toxiciteten för normala celler och de tillhörande biverkningarna.

Produkter mot cancer som gav de högsta intäkterna 2013 visas i fig. 6. Sextio procent av dessa produkter är rekombinanta proteiner, vilket stöder idén att produktion av rekombinanta proteiner fortfarande är en stigande och lovande plattform som ger utrymme för viktiga framsteg inom den biofarmaceutiska sektorn.

.