- Abstract
- 1 Introduktion
- 2 Material och metoder
- 2.1 Tillväxt av H. marismortui på glukos, acetat, glukos/acetatblandningar och på peptider
- 2.2 Beredning av celextrakt
- 2.3 Bestämning av enzymaktiviteter
- 3 Resultat
- 3.1 Tillväxt av acetatanpassade celler på glukos
- 3.2 Tillväxt av glukosanpassade celler på acetat
- 3.3 Tillväxt på glukos/acetatblandningar
- 3.4 Glukosanpassade celler på peptider
- 4 Diskussion
- 4.1 Acetatbildning i H. marismortui katalyseras av ACD som en del av ”overflow”-metabolismen
- 4.2 Acetataktivering till acetyl-CoA i H. marismortui katalyseras av ACS
- 4.3 Glukosspecifik katabolitrepression i H. marismortui
- Författarnoter
Abstract
Haloarcula marismortui bildade acetat under aerob tillväxt på glukos och använde acetat som tillväxtsubstrat. På glukos/acetatblandningar observerades diauxisk tillväxt med glukos som det föredragna substratet. Regleringen av enzymaktiviteter relaterade till glukos- och acetatmetabolismen analyserades. Man fann att både glukosdehydrogenas (GDH) och ADP-bildande acetyl-CoA-syntetas (ACD) uppreglerades under perioder av glukosförbrukning och acetatbildning, medan både AMP-bildande acetyl-CoA-syntetas (ACS) och malatsyntetas (MS) nedreglerades. Omvänt observerades uppreglering av ACS och MS och nedreglering av ACD och GDH under perioder av acetatförbrukning. MS uppreglerades också under tillväxt på peptider i avsaknad av acetat. Av uppgifterna drar vi slutsatsen att en glukosinducerbar ACD katalyserar acetatbildning medan acetataktivering katalyseras av en acetatinducerbar ACS; både ACS och MS induceras tydligen av acetat och undertrycks av glukos.
1 Introduktion
Vissa halofila arkéer, inklusive Haloarcula marismortui, växer på glukos, som bryts ned via en modifierad, halvfosforylerad Entner-Doudoroff (ED)-väg . Det har visats att det under exponentiell tillväxt på glukos bildas betydande mängder acetat . Nya studier visar att bildandet av acetat från acetyl-CoA i halofila arkéer katalyseras av ett ADP-bildande acetyl-CoA-syntetas (ACD) (acetyl-CoA + ADP + Pi⇆ acetat + ATP + CoA). Detta ovanliga synthetas hittades i alla acetatbildande arkéer, inklusive anaeroba hypertermofiler, och representerar en ny mekanism hos prokaryoter för acetatbildning och ATP-syntes. I anaeroba hypertermofila arkéer, t.ex. Pyrococcus furiosus, utgör ACD den viktigaste energibesparande reaktionen under socker-, pyruvat- och peptidmetabolismen . I motsats till arkealernas mekanism med ett enzym använder alla bakterier den ”klassiska” mekanismen med två enzymer för omvandling av acetyl-CoA till acetat, där fosfatacetyltransferas (PTA) och acetatkinas (AK) är inblandade .
Vissa haloarchaea, däribland H. marismortui, Haloferax volcanii och Halorubrum saccharovorum har rapporterats kunna växa på acetat som substrat. Metabolismen av acetat inleds genom dess aktivering till acetyl-CoA. Nyligen gav vi för första gången bevis för att acetataktivering till acetyl-CoA i haloarchaea katalyseras av ett AMP-bildande acetyl-CoA-syntetas (ACS) (acetat + ATP + CoA → acetyl-CoA + AMP + PPi) . ACS är det viktigaste enzymet för acetataktivering för de flesta acetatförbrukande organismer från alla tre livsdomäner . Endast ett fåtal bakterier, t.ex. Corynebacterium glutamicum, och även den acetoklastiska metanogena arkeonen Methanosarcina ssp. aktiverar acetat till acetyl-CoA via AK/PTA-paret . AK/PTA-vägen kan alltså fungera reversibelt in vivo, dvs. både i riktning mot acetatbildning och i riktning mot acetataktivering. Däremot tyder de första analyserna på att i haloarchaea ACD, den arkeala motsvarigheten till AK/PTA-paret, fungerar in vivo i riktning mot acetatbildning, även om enzymet katalyserar en reversibel reaktion in vitro.
För att ytterligare belysa den fysiologiska rollen och för att få en första inblick i den substratberoende regleringen av acetat- och acetyl-CoA-konverterande enzymer i haloarchaea utförde vi substratförskjutningsexperiment med H. marismortui och analyserade tillväxten på glukos, acetat, glukos/acetatblandningar och peptider. Under tillväxten analyserades aktivitetsprofiler för acetat- och acetyl-CoA-omvandlande enzymer, ACD och ACS, samt för glukosdehydrogenas, det första enzymet i glukosnedbrytningen via den modifierade ED-vägen. Dessutom bestämdes aktiviteterna hos malatsyntas, ett nyckelenzym i glyoxylatcykeln som föreslås vara verksamt i haloarchaea.
2 Material och metoder
2.1 Tillväxt av H. marismortui på glukos, acetat, glukos/acetatblandningar och på peptider
Haloarcula marismortui odlades aerobt vid 37 °C på ett komplext medium som innehöll jästextrakt, kasaminosyror och dessutom glukos och/eller acetat enligt tidigare beskrivning . För tillväxt på en blandning av glukos och acetat kompletterades detta medium med 12,5 mM glukos och 30 mM acetat. Tillväxt av peptider utfördes på det komplexa mediet i avsaknad av acetat och glukos. Tillväxtexperimenten utfördes i fermentorer på 2 liter (Fairmen Tec, Tyskland) med en omrörningshastighet på 500 varv per minut och en tryckluftsgenomströmning på 600 ml per minut. Tillväxten följdes genom att mäta den optiska densiteten vid 578 nm (ΔOD578). ΔOD578 på 1 motsvarar en proteinhalt på 0,5-0,6 mg/ml. Glukos och acetat bestämdes enzymatiskt enligt beskrivningen i .
2.2 Beredning av celextrakt
I olika tillväxtfaser skördades celler av H. marismortui (100-200 ml av kulturen) och celextrakt bereddes enligt beskrivningen i . Protein bestämdes med Bradfordmetoden med bovint serumalbumin som standard.
2.3 Bestämning av enzymaktiviteter
Alla enzymanalyser utfördes under aeroba förhållanden vid 37 °C i kuvetter fyllda med 1 ml analysblandning. Hjälpenzymerna tillsattes i allmänhet kort före reaktionsstart och det säkerställdes att dessa enzymer inte var hastighetsbegränsande. En enhet (1 U) enzymaktivitet definieras som 1 μmol substrat som förbrukas eller produkt som bildas per minut.
-
Acetyl-CoA-syntetas (ADP-bildande) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) mättes enligt beskrivningen i .
-
Acetyl-CoA-syntetas (AMP-bildande) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) övervakades som PPi- och AMP-beroende frisättning av HSCoA från acetyl-CoA enligt Srere et al. med Ellmans tiolreagens, 5′5-dithiobis (2-nitrobenzoesyra) (DTNB), genom att mäta bildningen av tiofenolatanjonen vid 412 nm (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Testblandningen innehöll 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetyl-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi och extrakt.
-
Malat-syntas (E.C. 4.1.3.2.) övervakades i en modifierad analys enligt Serrano et al. med DTNB. Testblandningen innehöll 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetyl-CoA, 0,5 mM glyoxylat och extrakt.
-
Glukosdehydrogenas (E.C. 1.1.1.1.47) mättes enligt Johnsen et al. .
-
Acetatkinas (E.C. 2.7.2.1.) mättes enligt beskrivningen i .
-
Phosphotransacetylas (E.C. 2.3.1.8.) övervakades som Piberoende frisättning av HSCoA från acetyl-CoA med DTNB . Testblandningen innehöll 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetyl-CoA, 5 mM KH2PO4 och extrakt.
3 Resultat
För att undersöka den fysiologiska funktionen och regleringen av enzymer som är relaterade till acetat- och acetyl-CoA-metabolismen, användes celler av H. marismortui som förväxlats på olika substrat flyttas till medium som innehåller acetat och/eller glukos respektive peptider, och aktivitetsprofiler för ACD, ACS, GDH och MS analyserades.
3.1 Tillväxt av acetatanpassade celler på glukos
Efter en fördröjningsfas växte cellerna exponentiellt och glukos förbrukades helt och hållet. Parallellt med glukosförbrukningen bildades betydande mängder acetat. Under denna period ökade aktiviteterna hos både GDH och ACD, medan aktiviteterna hos ACS och MS, som var aktiva i acetatanpassade celler, helt nedreglerades. I den stationära fasen återförbrukades den utsöndrade acetaten helt och hållet och både ACS- och MS-aktiviteterna ökade, medan GDH- och ACD-aktiviteterna minskade (fig. 1).
Växt av H. marismortui på glukos. Acetatanpassade celler användes som inokulum. ΔOD578 (fyllda rutor), glukoskoncentration (fyllda trianglar), acetatkoncentration (fyllda cirklar); enzymaktiviteter: ACD (fyllda diamanter), GDH (omvänt fyllda trianglar), ACS (öppna cirklar), MS (öppna trianglar).
Växt av H. marismortui på glukos. Acetatanpassade celler användes som inokulum. ΔOD578 (fyllda rutor), glukoskoncentration (fyllda trianglar), acetatkoncentration (fyllda cirklar); enzymaktiviteter: ACD (fyllda diamanter), GDH (omvänt fyllda trianglar), ACS (öppna cirklar), MS (öppna trianglar).
3.2 Tillväxt av glukosanpassade celler på acetat
Glukosanpassade celler växte på acetatinnehållande medium inledningsvis (ca 30 timmar) med en fördubblingstid på 10 timmar upp till en optisk densitet (ΔOD578) på 1. I denna tillväxtfas observerades ingen acetatförbrukning och cellerna växte på peptider som fanns i mediet. Efter denna period växte cellerna med en minskad tillväxthastighet upp till ΔOD578 på 1,8 och acetat förbrukades helt och hållet. Under acetatförbrukningen minskade ACD- och GDH-aktiviteterna, medan ACS- och MS-aktiviteterna, som inte kunde påvisas i glukosanpassade celler, ökade. Ökningen av MS-aktiviteten började under tillväxten på peptider, medan ökningen av ACS-aktiviteten skedde parallellt med acetatförbrukningen (fig. 2).
Växt av H. marismortui på acetat. Glukosanpassade celler användes som inokulum. Samma symboler användes som beskrivs i legenden till figur 1.
Växt av H. marismortui på acetat. Glukosanpassade celler användes som inokulum. Samma symboler användes som beskrivs i legenden till figur 1.
3.3 Tillväxt på glukos/acetatblandningar
Celler av H. marismortui som anpassats till jästextrakt och kasaminosyror överfördes till medium som innehöll både glukos och acetat. Cellerna uppvisade diauxisk tillväxt med sekventiellt utnyttjande av först glukos och sedan acetat. I den första tillväxtfasen växte cellerna upp till ΔOD578 på 4,0 och glukos förbrukades. Efter glukosförbrukning och en kort fördröjningsfas gick cellerna in i den andra tillväxtfasen, i vilken acetat metaboliserades och cellerna växte till en slutlig ΔOD578 på 5,2. I den första tillväxtfasen parallellt med glukosförbrukningen ökade ACD- och GDH-aktiviteterna, medan ACS-aktiviteten inte kunde påvisas och MS-aktiviteten var helt nedreglerad. I den andra tillväxtfasen parallellt med acetatförbrukningen ökade ACS- och MS-aktiviteterna och ACD- och GDH-aktiviteterna minskade (fig. 3).
Växt av H. marismortui på glukos/acetatblandning. Celler som anpassats till komplexa beståndsdelar i frånvaro av glukos och acetat användes som inokulum. Samma symboler användes som beskrivs i legenden till figur 1.
Växt av H. marismortui på glukos/acetatblandning. Celler som anpassats till komplexa beståndsdelar i avsaknad av glukos och acetat användes som inokulum. Samma symboler användes som beskrivs i legenden till figur 1.
3.4 Glukosanpassade celler på peptider
Glukosanpassade celler flyttades till ett medium som innehöll 0,25 % jästextrakt och 0,5 % casaminosyror i frånvaro av både glukos och acetat. Cellerna växte med en fördubblingstid på 13 timmar upp till ΔOD578 på 2,5. Acetatbildning kunde inte påvisas. Under exponentiell tillväxt minskade ACD (från 60 till 20 mU/mg) och GDH (från 80 till 40 mU/mg), och MS-aktiviteten, som inledningsvis inte kunde påvisas, ökade upp till 20 mU/mg. ACS-aktiviteten kunde inte påvisas under den exponentiella tillväxtfasen, men ökade under den stationära fasen (13 mU/mg).
4 Diskussion
I denna artikel har vi analyserat den fysiologiska rollen för acetat- och acetyl-CoA-omvandlande enzymer (ACD, ACS) i H. marismortui och ger de första beläggen för en substratspecifik reglering av dessa enzymer liksom för GDH och MS. Uppgifterna diskuteras i jämförelse med kända bakteriesystem.
4.1 Acetatbildning i H. marismortui katalyseras av ACD som en del av ”overflow”-metabolismen
Under tillväxt på glukos och på glukos/acetatblandningar ökade både ACD- och GDH-aktiviteterna parallellt med faser av glukosförbrukning och acetatbildning (fig. 1 och 3). Omvänt minskade båda aktiviteterna under tillväxt på acetat eller peptider. Dessa data och frånvaron av AK/PTA tyder på att bildningen av acetat i Haloarcula katalyseras av ACD. Den fysiologiska rollen för acetatbildningen i H. marismortui och dess reglering under aerob tillväxt på glukos är inte klarlagd; acetatbildningen kan vara en del av en ”överflödsmetabolism”, som har studerats ganska detaljerat i olika bakterier, t.ex. Escherichia coli och Bacillus subtilis. Liksom i H. marismortui utsöndrar båda bakterierna acetat under aerob tillväxt på överskottsglukos och återanvänder det i den stationära fasen . Det har spekulerats att utsöndring av acetat sker under förhållanden när glykolysens hastighet överstiger den för efterföljande vägar, t.ex. citronsyracykeln och den andning som krävs för fullständig oxidation av glukos . Under dessa förhållanden omvandlas acetyl-CoA till acetat och utsöndras. I enlighet med detta synsätt visar transkriptionsanalyser med både E. coli och B. subtilis på glukosspecifik induktion av glykolytiska gener och repression av gener för citronsyracykeln och andning . En liknande glukosspecifik transkriptionsreglering, dvs. uppreglering av glykolytiska gener i den modifierade Entner-Doudoroff-vägen och nedreglering av vissa gener i citronsyracykeln och för andning, har nyligen rapporterats för den halofila arkeonen H. volcanii. Det är därför troligt att haloarchaea har en glukosspecifik överflödsmetabolism som resulterar i acetatbildning. Acetatbildning i E. coli och B. subtilis involverar den bakteriella mekanismen med två enzymer via PTA och AK, medan acetatbildning i Haloarcula katalyseras av ACD, den arkealiska mekanismen med ett enzym. I både E. coli och B. subtilis visade sig glukos inducera de kodande pta- och ack-generna, vilket tyder på en samordnad reglering av glykolys och acetatbildning. Hittills har transkriptionell reglering av den acetatbildande ACD i arkeonen H. marismortui inte analyserats. Den samordnade regleringen av GDH- och ACD-aktiviteten tyder dock på en liknande glukosspecifik transkriptionell reglering av både glykolysen genom den modifierade Entner-Doudoroff-vägen och av acetatbildningen genom ACD.
Under aerob tillväxt på peptider bildade H. marismortui inte acetat och ACD-aktiviteten var nedreglerad. I detta avseende skiljer sig Haloarcula från bakterien E. coli, som bildar betydande mängder acetat under aerob tillväxt på peptider i samband med en ”överflödsmetabolism”. H. marismortui skiljer sig också från den anaeroba hypertermofila arkeonen P. furiosus och andra anaeroba, hypertermofila arkéer, som bildar stora mängder acetat genom ACD under anaerob tillväxt på både sockerarter och peptider. Under anaerob peptid- och sockerfermentering hos P. furiosus utgör acetatbildning genom ACD den viktigaste platsen för ATP-bildning via fosforylering på substratnivå. Under aerob nedbrytning av socker och peptider hos H. marismortui däremot bevaras den mesta energin genom fosforylering genom elektrontransport i andningskedjan, och därför är acetatbildning genom ACD mindre viktig eller onödig. Således verkar acetatbildning genom ACD i Haloarcula vara begränsad till sockermetabolism under loppet av en ”överflödig” metabolism.
4.2 Acetataktivering till acetyl-CoA i H. marismortui katalyseras av ACS
Detta drogs av slutsatsen från uppregleringen av ACS-aktiviteten parallellt med acetatförbrukningen (fig. 1, 2, 3). En roll för ACD vid acetataktivering kunde uteslutas eftersom ACD nedreglerades under perioder av acetatförbrukning. ACD i Haloarcula verkar alltså in vivo endast i riktning mot acetatbildning. ACS är också den vanligaste mekanismen för acetataktivering i bakterier där den är strikt reglerad. I E. coli och B. subtilis induceras t.ex. acs-genen av acetat och undertrycks av glukos . I Haloarcula tyder uppregleringen av ACS-aktiviteten av acetat och nedregleringen av glukos på en liknande reglering på transkriptionsnivå som den som rapporterats för bakterier. Det bör noteras att i motsats till E. coli och B. subtilis aktiverar bakterien C. glutamicum acetat genom en acetatinducerad AK/PTA-väg .
Aktiviteten hos MS, ett nyckelenzym i glyoxylatcykeln, uppreglerades under perioder av acetatkonsumtion i H. marismortui tillsammans med ACS, vilket tyder på en acetatspecifik koordinerad reglering av ACS och den anaplerotiska glyoxylatcykeln. Både MS- och ACS-aktiviteten reglerades nedåt av glukos. Samordnad acetatspecifik induktion av gener för enzymer för acetataktivering (se ovan) och för glyoxylatvägen har rapporterats för flera bakterier, däribland E. coli och C. glutamicum. Nyligen har de första bevisen för induktion av både malatsyntes- och isocitratlyasgener av acetat givits för den halofila arkeonen H. volcanii.
Hur som helst var dock MS-aktiviteten snarare än ACS-aktiviteten också uppreglerad under exponentiell tillväxt på peptider i avsaknad av acetat, vilket tyder på att regleringen av MS är mer komplex och inte begränsad till acetat. En roll för MS (och för glyoxylatcykeln) i peptidmetabolismen kan förklaras av att många aminosyror bryts ned till acetyl-CoA, vilket skulle kräva en fungerande glyoxylatväg för anabolism. Ökningen av ACS-aktiviteten, som observerades i den stationära fasen under tillväxt på peptider, kan hittills inte förklaras, den kan bero på en allmän stressreaktion hos celler i stationär fas .
4.3 Glukosspecifik katabolitrepression i H. marismortui
Haloarcula marismortui uppvisade diauxisk tillväxt på glukos/acetat-blandningar med glukos som föredraget substrat, vilket indikerar någon form av katabolisk repression av acetatutnyttjandet av glukos. Glukosspecifik katabolitrepression har hittills inte analyserats i arkéer. I bakterier har den molekylära grunden för kolkatabolitrepressalier av glukos studerats i detalj, t.ex. i E. coli och B. subtilis. Under tillväxt av C. glutamicum på glukos/acetatblandningar beskrevs monofasisk tillväxt med samtidig konsumtion av acetat och glukos, medan acetat är det föredragna substratet i Azotobacter vinelandii. De reglerande principerna bakom dessa egenskaper undersöks för närvarande.
Det krävs ytterligare studier för att styrka den föreslagna substratspecifika regleringen av acetatbildande och acetataktiverande enzymer, ACD och ACS, i förhållande till acetat- och glukosmetabolismen på transkriptionell nivå. Dessa studier, som kräver rening och identifiering av de kodande generna för ACD och ACS från H. marismortui pågår.
(
)
.
.
,
–
.
(
)
.
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
. Online publication, doi:
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
(
)
.
,
–
.
Författarnoter
Redaktör: Dieter Jahn