Analys av endocannabinoidsystemets (EC) nyckelmolekyler 2-arachidonoylglycerol (2AG) och arachidonoyletanolamid (anandamid, AEA) är en utmaning på grund av flera särdrag. 2AG isomeriseras spontant till sin biologiskt inaktiva analog 1-arachidonoylglycerol (1AG) genom acylmigration och är endast kromatografiskt särskiljbar från 1AG. Matrixeffekter som främst orsakas av samextraherade fosfolipider kan ytterligare försvåra analysen. Dessutom är 2AG och 1AG instabila under vissa förhållanden, t.ex. vid avdunstning av lösningsmedel eller rekonstituering av torkade extrakt. Vi undersökte effekterna av olika organiska lösningsmedel och deras blandningar, t.ex. toluen, etylacetat och kloroform-metanol, på 2AG/1AG-isomeriseringen, 2AG/1AG-stabiliteten och matris-effekter vid UPLC-MS/MS-analys av 2AG och AEA i human plasma. Toluen förhindrade både isomerisering av 2AG till 1AG och nedbrytning av 2AG/1AG under avdunstning. Toluenextrakt innehåller endast 2 % av plasmafosfolipider som orsakar matrixeffekter jämfört med extrakt från den traditionellt använda lösningsmedelsblandningen kloroform-metanol. Toluen och alla andra testade organiska lösningsmedel ger jämförbara extraktionsresultat av 2AG och AEA (60-80 %). Baserat på dessa gynnsamma egenskaper hos toluen har vi utvecklat och validerat en UPLC-MS/MS-metod med positiv elektrosprayjonisering (ESI+) som gör det möjligt att samtidigt mäta 2AG och AEA i human plasma på ett korrekt och exakt sätt. UPLC-MS/MS-metoden korsvaliderades med en tidigare beskriven fullt validerad GC-MS/MS-metod för AEA i human plasma. En nära korrelation (r(2)=0,821) observerades mellan resultaten från UPLC-MS/MS (y) och GC-MS/MS (x) metoderna (y=0,01+0,85x). UPLC-MS/MS-metoden är lämplig för rutinmässig mätning av 2AG och AEA i plasmaprover från människor (1 ml) i kliniska miljöer, vilket visades av kvalitetskontrollplasmaprover som behandlades under en period av 100 dagar. UPLC-MS/MS-metoden utvidgades ytterligare till att omfatta human urin. I urin kunde AEA inte påvisas och 2AG påvisades i endast 3 av 19 prover från friska försökspersoner vid 160, 180 och 212 pM, vilket motsvarar 12,3, 14,5 respektive 9,9 pmol/mmol kreatinin.