Stabilitetsstudier av tiokolchicosid i bulk och kapslar med hjälp av RP-HPTLC/Densitometri

Abstract

En ny stabilitetsindikerande kromatografisk metod med omvänd fas och högpresterande tunnskiktskromatografi (RP-HPTLC) för densitometrisk analys av tiokolchicosid har utvecklats och validerats. Kromatogrammen utvecklades med hjälp av aluminiumplattor förbelagda med kiselgel 60 RP-18 F254S som stationär fas och metanol : vatten (70 : 30 ) som rörlig fas. Det kompakta bandet för tiokolchicosid observerades vid ett värde av vid en absorptionsvåglängd på 377 nm. Linjära regressionsdata för kalibreringsdiagrammen () hittades med avseende på toppområdet i koncentrationsintervallet 100-600 ng per band. Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) var 9,77 ng respektive 29,63 ng. Läkemedlet utsattes för sur och alkalisk hydrolys, oxidation, fotodegradering och torrvärme. Nedbrytningsprodukternas toppar var väl upplösta från standardläkemedlets topp med signifikant olika värden. Statistisk analys visade att den etablerade RP-HPTLC-metoden är reproducerbar, selektiv och noggrann för bestämning av tiokolchicosid i dess formuleringar. Metoden kan effektivt separera läkemedlet från dess nedbrytningsprodukter, och den kan betraktas som en stabilitetsindikerande analys.

1. Introduktion

Thiocolchicosid är kemiskt sett 2-demetoxi-2-glukosidoxythicolchicin (figur 1) . Tiokolchicosid är ett halvsyntetiskt svavelderivat av kolchicosid, en naturligt förekommande glukosid som finns i växten Gloriosa superba. Kliniskt används tiokolchicosid för muskelavslappnande, antiinflammatoriska och analgetiska egenskaper . Få LC-MS-MS-metoder har etablerats för bedömning av bioekvivalens av tiokolchicosid som enskild komponent och i en kombinationstablett med fast dos med lornoxicam .

Figur 1

Kemisk struktur för tiokolchicosid.

Vissa analysmetoder, t.ex. LC-ESI-MS RP-HPLC och UV-spektrofotometri, har fastställts för bestämning av enbart tiokolchicosid i bulk och farmaceutiska formuleringar.

Thiocolchicosid finns i kombination med många andra läkemedel; därför har flera metoder såsom UV-spektrofotometriska , RP-HPLC och HPTLC-metoder studerats för bestämning av tiocolchicosid i kombinerade doseringsformer.

I ICH-riktlinjerna (International Conference on Harmonization) med titeln ”Stability Testing of New Drug Substances and Products” krävs att stresstester kan utföras för att belysa den aktiva substansens inneboende stabilitetsegenskaper. En idealisk stabilitetsindikerande metod är en metod som löser upp standardläkemedlet samt dess nedbrytningsprodukter . Därför måste en tillförlitlig och snabb bestämningsmetod utvecklas, som också kan användas för att uppnå en optimal separation av nedbrytningskomponenterna från grundsubstansen. Såvitt vi vet har dock ingen artikel om stabilitetsindicerande RP-HPTLC-bestämning av tiokolchicosid någonsin nämnts i litteraturen. Syftet med det arbete som beskrivs i denna artikel är att fastställa villkor för identifiering och kvantitativ analys av tiokolchicosid i närvaro av dess nedbrytningsprodukter för bedömning av renheten hos bulkläkemedlet och stabiliteten hos dess doseringsformer. Lämpligheten av den stabilitetsindikerande RP-HPTLC-metoden för kvantitativ bestämning av tiokolchicosid bevisades genom validering i enlighet med kraven i ICH-riktlinjerna.

2. Experimentella

2.1. Kemikalier och reagenser

Thiocolchicosid erhölls som ett gåvoprov från Ajanta Pharma. Ltd, Mumbai, Indien. Metanol av HPLC-kvalitet, HCl, NaOH och H2O2 köptes från Merck Chemicals, Indien.

2.2. HPTLC-instrumentering

Läkemedelsstandarden och proverna spottas i form av 6 mm breda band med en CAMAG Linomat-mikroliterspruta (100 μL, Hamilton, Bunaduz, Schweiz) med hjälp av en CAMAG Linomat-applikator för 5 prover (CAMAG Muttenz, Schweiz) med en konstant appliceringshastighet, 150 nL per sekund. Plattorna förtvättades med metanol och aktiverades vid 100 °C i 10 minuter före kromatografi. Kromatografin utfördes på aluminiumplattor belagda med kiselgel 60 RP-18 F254S (20 × 10 cm, E. Merck, Tyskland). Linjär stigande utveckling med metanol: vatten (70 : 30 v/v) som rörlig fas utfördes i en 20 × 10 cm glaskammare med dubbla tråg (CAMAG Muttenz, Schweiz). Den optimerade mättnadstiden för den rörliga fasen i kammaren var 30 minuter vid rumstemperatur (28 ± 2 °C). Längden på kromatogrammen var cirka 80 mm. Utvecklingstiden för plattan var 25 minuter. Efter utveckling torkades plattorna i luftström i en lufttork. Detektering av fläckar utfördes sedan vid 377 nm med en CAMAG TLC Scanner 3 i absorbansläge som styrdes av winCATS-programvaran version 1.3.0. Strålningskällan var en deuteriumlampa. Spaltdimensionerna var 6 mm × 0,45 mm och skanningshastigheten 20 mm per sekund.

2.3. Beredning av standardiserade lager

Standardiserad lagerlösning med 1 mg/ml tiokolchicosid i metanol.

2.4. Linjäritetsstudie

Stockstandardlösning i intervallet 0,2 till 1,2 ml överfördes till sex separata 10 ml mätkolvar och volymen fylldes på med metanol. Från var och en av ovanstående lösningar applicerades 5 μL på RP-HPTLC-plattor för att erhålla en koncentration i intervallet 100 till 600 ng per band. Kalibreringsdiagrammet för metoden konstruerades som toppyta mot läkemedelskoncentrationen.

2,5. Beredning av provlösning

För att bestämma innehållet av tiokolchicosid i kapseln vägdes tjugo kapslar (MYORIL, märkningsangivelse: 8 mg tiokolchicosid per kapsel); innehållet i kapslarna avlägsnades; och medelvikten bestämdes. En mängd motsvarande 8 mg tiokolchicosid överfördes till en 100 ml mätkolv med 50 ml metanol och sonicerades i 10 min. Volymen justerades till märket och filtrerades med Whatmann nr 41-filterpapper. En volym på 5 mL späddes till 10 mL med metanol. Den resulterande lösningen, 5 μL, applicerades på RP-HPTLC-platta för analys av tiokolchicosid. Plattorna utvecklades och skannades enligt beskrivningen ovan.

2.6. Metodvalidering

Metoden validerades för följande parametrar enligt ICH-riktlinjerna.

2.6.1. Precision

Upprepning av provtillämpningen och mätning av topparean utfördes med sex replikat av testkoncentrationen (400 ng per band av tiokolchicosid). Variationen inom och mellan dagar för uppskattning av tiokolchicosid utfördes med hjälp av tre replikat vid tre olika koncentrationsnivåer (200, 300 och 500 ng per band).

2.6.2. Detektionsgräns (LOD) och kvantifieringsgräns (LOQ)

För att bestämma detektions- och kvantifieringsgränsen användes tiokolchicosidkoncentrationer i den nedre delen av kalibreringskurvans linjära intervall. Från standardlösningen applicerades tiokolchicosid 100, 120, 140, 160, 180 och 200 ng per band i tre exemplar på RP-HPTLC-plattan och LOD och LOQ beräknades med hjälp av följande ekvationer: där ”” är standardavvikelsen för topparnas areor för drogerna (), som tas som ett mått på bruset och ”” är lutningen på motsvarande kalibreringskurva.

2.6.3. Specificitet

Metodens specificitet kontrollerades genom att analysera läkemedelsstandard och prov. Bandet för tiokolchicosid i provet bekräftades genom att jämföra bandets värden och spektrum med dem för läkemedelsstandarden. Topprenheten för tiokolchicosid bekräftades genom att jämföra spektren på tre olika nivåer, dvs. positionerna för bandets toppstart (), topp-apex () och toppslut ().

2.6.4. Robusthet

Metodens robusthet utfördes genom att 400 ng tiokolchicosid analyserades av två olika analytiker under samma experimentella och miljömässiga förhållanden.

2.6.5. Noggrannhet

Nio band av tiokolchicosidprovlösning (200 ng per band) applicerades på plattan, och sedan applicerades den kända mängden tiokolchicosid i tre exemplar vid 80, 100 och 120 % (160, 200 och 240 ng per band) av provkoncentrationen (200 ng per band) och analyserades på nytt med den föreslagna metoden. Detta gjordes för att utvärdera återvinningsstudien av läkemedlet vid olika nivåer i formuleringarna.

2.6.6. Robusthet

Genom att göra små ändringar av den mobila fasens sammansättning, mängden mobil fas, tiden från applicering till utveckling och tiden från utveckling till skanning undersöktes effekterna på resultaten. Mobila faser med olika sammansättningar av metanol: vatten (72 : 28 v/v) och metanol: vatten (68 : 32 v/v) provades och kromatogrammen kördes. Plattorna förtvättades med metanol och aktiverades vid 80 ± 5 °C i 2, 5 och 8 minuter före kromatografin. Metodens robusthet testades med hjälp av sex replikat av samma fläck (400 ng per band av tiokolchicosid).

2.7. Tvångsdegradering av tiokolchicosid

2.7.1. Syra- och bashydrolys

En noggrant vägd kvantitet på 10 mg tiokolochicosid löstes separat i 10 mL metanolösning av 1,0 M HCl respektive 0,5 M NaOH och återflödes i 30 minuter vid 60 °C i mörker för att undvika sannolik nedbrytande effekt av ljus. En volym på 1,0 mL av ovanstående lösningar togs separat, neutraliserades och späddes upp till 10 mL med metanol. De resulterande lösningarna applicerades på RP-HPTLC-plattorna i tre exemplar (5 μL vardera, dvs. 500 ng per band). Kromatogrammen utvecklades och skannades enligt ovan.

2.7.2. Oxidativ nedbrytning

För oxidativ nedbrytning löstes noggrant vägd mängd 10 mg tioklochicosid separat i 10 mL metanolösning av 1 % v/v H2O2 respektive 3 % v/v H2O2 och förvarades i mörker i rumstemperatur i 30 minuter. Efter 30 minuter togs 1,0 mL från var och en av ovanstående lösningar och späddes upp till 10 mL med metanol. De resulterande lösningarna applicerades på RP-HPTLC-plattor i tre exemplar (5 μL vardera, dvs. 500 ng per band). Kromatogrammen utvecklades och skannades enligt ovan.

2.7.3. Nedbrytning genom torrvärme

En noggrant vägd mängd 10 mg tiokolchicosid förvarades vid 70°C i 8 timmar i en ugn. Den överfördes till en 10 ml mätkolv med metanol och volymen fylldes upp till märket. 1,0 mL av ovanstående lösning togs och späddes upp till 10 mL med metanol. Den resulterande lösningen applicerades på RP-HPTLC-plattan i tre exemplar (5 μL vardera, dvs. 500 ng per band). Kromatogrammet utvecklades och skannades enligt ovan.

2.7.4. Fotodegradering

En noggrant vägd mängd 10 mg tiokolchicosid löstes i 10 mL metanol och lösningarna förvarades under 24 timmar i ljuset. En lämplig volym 1,0 mL av ovanstående lösning togs och späddes upp till 10 mL med metanol. Den resulterande lösningen applicerades på RP-HPTLC-plattan i tre exemplar (5 μL vardera, dvs. 500 ng per band). Kromatogrammet utvecklades och skannades enligt ovan.

3. Resultat och diskussion

3.1. Utveckling av optimal mobilfas

För valet av lämplig mobilfas för separering av tiokolchicosid utfördes flera körningar med hjälp av mobilfaser som innehöll lösningsmedel med varierande polaritet, vid olika koncentrationsnivåer. Bland de olika kombinationer av mobila faser som användes gav den mobila fas som bestod av metanol: vatten (70 : 30 v/v) en skarp och väldefinierad topp vid värdet 0,60 ± 0,02 (figur 2). De väl avgränsade banden uppstod när kammaren var mättad med den rörliga fasen i 30 minuter i rumstemperatur.

Figur 2

Kromatogram av tiokolchicosidstandard med ( 0,60 ± 0,02) vid 377 nm i metanol: vatten (70 : 30 v/v) som rörlig fas.

3.2. Kalibreringskurva

De linjära regressionsdata för kalibreringskurvorna () visade ett gott linjärt förhållande över koncentrationsområdet 100-600 ng per band. Den linjära regressionsekvationen visade sig vara , = 0,9984 (figur 3).

Figur 3

Kalibreringskurva för tiokolchicosid (100-600 ng per band).

3.3. Validering av metoden

Den utvecklade metoden validerades enligt ICH:s riktlinjer.

Metodens precision avslöjades i form av % relativ standardavvikelse (% RSD) för toppområdet. Resultaten (tabell 1) visade på metodens ljudprecision som bestämdes av lutningen på den lägsta delen av kalibreringsdiagrammet. LOD- och LOQ-värdena visade sig vara 9,77 ng respektive 29,63 ng, vilket tyder på att metodens känslighet är tillräcklig.

Parametrar Koncentration (ng per band) % Funnen mängd % RSD Förnybarheten () 400 99.39 0.61 Intradag () 200 100.73 0.64 300 99.83 0.78 500 99.18 0.32 Interday () 200 100.80 1.43 300 99.65 0.70 500 99.91 0.50

: antal bestämningar.

Tabell 1

Förnyelsebarhet och noggrannhet inom och mellan dagar.

Retureringsstudierna utfördes vid 80 %, 100 % och 120 % av testkoncentrationen i enlighet med ICH-riktlinjerna. Den procentuella återvinningen av tiokolchicosid vid alla tre nivåerna befanns ligga inom intervallet 99,92-100,04 %. De tillsatta och bestämda läkemedelsmängderna och den procentuella återvinningen visas i (tabell 2). Tiokolchicosids topprenhet bekräftades genom att utvärdera spektralstudierna vid bandets toppstart-, topp-apex- och toppslutpositioner, dvs. (, ) = 0,9995 och (, ) = 0,9986, vilket visar metodens specificitet (figur 4). God korrelation ( = 0,9989) erhölls mellan läkemedelsstandard och läkemedel extraherat från kapselformuleringen. Metodens robusthet experimenterades genom att göra avsiktliga ändringar i de kromatografiska förhållandena, och effekten på kromatogrammet observerades. Standardavvikelsen för toppytorna beräknades för varje parameter, och % RSD visade sig vara mindre än 2 %. De låga värdena för % RSD visar att metoden är robust; resultaten visas i (tabell 3). Metodens robusthet verifierades av olika analytiker och % RSD visade sig vara 0,57 och 0,58, vilket tyder på att metoden är robust.

3.4. Analys av den saluförda formuleringen

Thiokolchicosid när den extraherades från kapselformuleringen uppvisade en enda fläck med = 0,60 ± 0,02 i kromatogrammet. Det genomsnittliga procentuella läkemedelsinnehållet visade sig vara 100,27 % av det angivna värdet på etiketten med 0,88 % RSD.

3.5. Stabilitetsindikerande egenskaper

3.5.1. Sura nedbrytning

Den forcerade nedbrytningen av tiokolchicosid i 1,0 M HCl (60 °C i 30 minuter) visade sig vara instabil och uppvisade två ytterligare toppar vid värdena 0,33 och 0,71 (figur 5(a)). Fläckarna för de nedbrutna produkterna var väl åtskilda från fläckarna för tiokolchikosid.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.5.2. Basisk nedbrytning

Thiocolchicosid visade sig vara instabil under alkalihydrolys i 0,5 M NaOH vid 60°C i 30 minuter. Läkemedlet visade en ytterligare topp vid värdet 0,72 med tiokolchicosid kvar vid 0,60 (figur 5(b)). De nedbrutna produkternas fläckar var väl separerade från läkemedelsfläckarna.

3.5.3. Oxidativ nedbrytning

Thiocolchicosid besitter en svavelatom som är mer mottaglig för oxidation av H2O2. Efter behandling av tiokolchicosid med 1 % v/v H2O2 observerades tre ytterligare toppar vid värdena 0,38, 0,46 och 0,70 tillsammans med tiokolchicosid som förblev vid 0,60 (figur 5(c)). Vid oxidativ nedbrytning med 3 % v/v H2O2 genomgick tiokolchicosid fullständig nedbrytning, vilket resulterade i två större toppar vid värdena 0,58 och 0,64 respektive en topp vid 0,70 (figur 5(d)). Spektren för topprenhet av tiokolchicosid som återvinns efter nedbrytning i 1 M HCl, 0,5 M NaOH och 1 % v/v H2O2 och tiokolchicosidstandard som skannats vid toppens start-, topp-apex- och toppens slutpositioner visas i (figur 6). Resultaten från stressteststudierna visade att metoden var mycket specifik för tiokolchicosid. Nedbrytningsprodukterna var helt och hållet märkbara från moderföreningen. Ingen nedbrytning identifierades vid exponering av läkemedelslösningen för solljus under foto- och termisk nedbrytning, vilket visar att läkemedlet är stabilt under båda förhållandena. Resultaten av den forcerade nedbrytningsstudien av tiokolchicosid sammanfattas i (tabell 4).

Figur 6

Peak-purity-spektra av tiokolchicosid som återfanns efter nedbrytning i 1 M HCl, 0.5 M NaOH, 1 % v/v H2O2, nedbrytningsmedel och tiokolchicosidstandard som skannades vid toppstart, topp-apex och toppslutpositioner.

4. Slutsats

I den här studien utfördes forcerad nedbrytning av tiokolchicosid för att belysa dess inneboende kemiska stabilitet. För detta ändamål har en RP-HPTLC-metod utvecklats. Den utvecklade metoden visade sig vara enkel, snabb, selektiv, känslig och lämplig för bestämning av tiokolchicosid i bulkmaterial och kapselformuleringar. Under studien konstaterades att tiokolchicosid är känslig för syra- och bashydrolys samt oxidation. Eftersom metoden är stabilitetsindikerande kan den användas för att bestämma renheten hos det läkemedel som finns tillgängligt från olika källor genom att detektera relaterade föroreningar. Dessutom kan man dra slutsatsen att de föroreningar som finns i läkemedlet kan bero på hydrolys eller oxidation under bearbetning och lagring av läkemedlet.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Ansvar

Författarna är tacksamma mot R. C. Patel Institute of Pharmaceutical Education and Research, Shirpur (M.S.), Indien, för att ha tillhandahållit de faciliteter som krävdes för att genomföra detta forskningsarbete.