Cellöverlevnad efter bestrålning
Undersökning av strålningsinducerad celltillväxt och celldöd, definieras som den tidsperiod som krävs för en fullständig förlust av spridningskapaciteten eller en ökning av spridningskapaciteten, är en av de vanligaste och mest tillförlitliga metoderna för att studera strålningseffekter på celler. För bestrålningsexperimenten verifierade vårt laboratorium att avläsningarna av 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) stod i proportion till antalet celler in vitro, åtminstone i den exponentiella tillväxtfasen (data visas inte). 12C6+ jonbestrålning med hög energi leder vanligtvis till att den stora majoriteten av cellerna dör. Andelen celldöd i fördröjningsfasen efter bestrålning och förändringar i fördubblingstiden kan mätas genom analyser vid olika tidpunkter efter bestrålning. Eftersom vår analys inte bara var en enkelpunktsbestämning av överlevnad, kunde information om tillväxtprestanda också lätt erhållas. Överlevnadskurvan ritades på en naturlig logaritmisk skala av överlevnadsfraktionen mot olika fysiska parametrar.
C. tyrobutyricum 25755-celler bestrålades 20 timmar efter sådd. Stammarna med lägst metabolisk aktivitet och långsammaste proliferation eller celler som upphörde att proliferera exkluderades från analysen genom tvättning och trypsinisering när utplaceringen gjordes efter bestrålning. Överlevnadsfraktionen enligt ekvation (1) jämfördes med en representativ uppsättning experimentella data. Figur 1 visar en jämförelse av överlevnadskurvorna efter 12C6+-jonbestrålning vid olika strålenergier för de olika stammarna av C. tyrobutyricum ATCC 25755. Resultaten av MTT-analysen plottas mot bestrålningsdosen (10 till 50 Gy) vid 68 AMeV energi och 106 till 108 joner – puls-1 nivåer, som var e0 → e-4,5 för figur 1A, e0 → e-5,8 för figur 1B och e0 → 0 för figur 1C. Figur 1D-F visar cellöverlevnadsdata från resultaten av MTT-analysen mot bestrålningsdosen (10 till 50 Gy) vid 114 AMeV energi och 106 till 108 joner – puls-1-nivåer, som var e0 → 0. Generellt sett uppnåddes tillräcklig överensstämmelse mellan beräkningarna och de experimentella uppgifterna. För de stammar som behandlades vid 68 AMeV underskattade ekvationen dosens effektivitet, medan resultatet överskattades för de celler som bestrålades vid höga energier (114 AMeV). Den maximala avvikelsen, som härrör från förhållandet mellan beräknade och uppmätta doser för en given effektnivå, var 15 %. Stammarnas överlevnadsandel var starkt beroende av 12C6+-jonstrålens särskilda fysiska egenskaper, som bestäms av energi-, dos- och jon-puls-1-nivåerna för de aktuella partiklarna (figur 1). Det är uppenbart att överlevnadsfraktionen minskade med ökande koljonenergi. Som förväntat visade överlevnadslogaritmen för analyserna samma egenskaper: överlevnaden var beroende av 12C6+-jonbestrålningens energi, jon-puls-1 och dos. Ökningen av en fysisk parameter i taget ledde till en minskning av överlevnaden. Mycket begränsad överlevnad (e-3,5 → e-6,5) erhölls när 12C6+-jonen bestrålades med 114 AMeV energi, en dos på 20-40 Gy och 106-108 joner-puls-1.
Effekten av bestrålning med 12C6+-joner på överlevnaden hos Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Cellerna bestrålades 20 timmar efter sådd och graden av överlevnad bestämdes med MTT-analys. Överlevnadsdata har plottats mot bestrålningsnivåerna. (A-C) 12C6+-joner accelererades upp till 68 AMeV, och deras joner/impuls varierade från 106 till 108, vid en doshastighet på 10 till 50 Gy. (D-F) 12C6+-joner accelererades upp till 114 AMeV, och deras joner/impuls varierade från 106 till 108, vid en doshastighet på 10 till 50 Gy. Celler med låg metabolisk aktivitet och långsam proliferation eller celler som upphör att proliferera exkluderades från analysen genom tvättning och trypsinisering när plottningen gjordes efter bestrålning.
Många celltyper kännetecknas av regelbunden celldelning var 12:e till 24:e timme. På grund av kraften i den exponentiella tillväxten kan en enskild cell producera tusentals dotterceller inom cirka 9 till 12 normala delningscykler, det vill säga på några dagar. Efter bestrålning kan de överlevande sedan bestå av vissa mutanter. En mycket liten andel av de överlevande C. tyrobutyricum ATCC 25755 kan uppvisa en förbättrad förmåga att producera butyrat.
Butyrsyras effekter på celltillväxt efter bestrålning
C. tyrobutyricum ATCC 25755 använder glukos eller xylos som kol- och energikälla. Monosackariden transporteras in i cellen via ett fosfenolpyruvatberoende fosfotransferasupptagningssystem. Därefter metaboliseras glukos eller xylos via glykolys, som uppvisar ett obetydligt pH-beroende i intervallet pH 7 till pH 5,5. Fermenteringarna stoppades dock när glukos eller xylos inte längre förbrukades av cellerna på grund av inhibering av butyrat. För att ytterligare undersöka den specifika effekten av bestrålning på celltillväxtprofilerna (baserat på mätningar av den optiska densiteten (OD) av cellsuspensionen vid 600 nm) utfördes enskilda batchkulturer i kemiskt definierat P2-medium (utfört i serumflaskor) som innehöll 42 g-L-1 glukos och som kompletterades med 3,6, 7,2 och 10,8 g-L-1 smörsyra. pH-värdet i kulturen av C. tyrobutyricum ATCC 25755 (figur 2A, kontroll) sjönk till cirka 4,8 (ΔpH på 1,4, från pH 6,2) jämfört med när den kompletterades med 3,6 g-L-1 smörsyra (figur 2A1), 7.2 g-L-1 smörsyra (figur 2A2) och 10,8 g-L-1 smörsyra (figur 2A3), var motsvarande pH-värden cirka 6,0 (ΔpH på 0,5 från 6,5), 6,1 (ΔpH på 0,3 från 6,4) respektive 5,9 (ΔpH på 0,5 från 6,4). När kulturen bestrålades med 68 AMeV vid en dos av 40 Gy (figur 2D, kontroll) sjönk pH-värdet till omkring 4,8 (ΔpH på 1,7 från och med 6,5), medan det vid en dos av 40 Gy (kompletterad med 3,6 g-L-1 smörsyra) (figur 2D1), en dos av 40 Gy (kompletterad med 7.2 g-L-1 smörsyra) (figur 2D2) och en dos av 40 Gy (kompletterad med 10,8 g-L-1 smörsyra) (figur 2D3) var pH-värdena ungefär 4,6 (ΔpH på 1,6 från och med 6,2), 4,8 (ΔpH på 1,4 från och med 6,2) respektive 5,9 (ΔpH på 0,3 från och med 6,2). När kulturen bestrålades med 114 AMeV och en dos av 40 Gy (figur 2G, kontroll) sjönk pH-värdet till omkring 5,7 (ΔpH på 0,6 från 6,3), medan det vid en dos av 40 Gy (kompletterad med 3,6 g-L-1 smörsyra) (figur 2G1), en dos av 40 Gy (kompletterad med 7.2 g-L-1 smörsyra) (figur 2G2) och en dos av 40 Gy (kompletterad med 10,8 g-L-1 smörsyra) (figur 2G3) var pH-värdena cirka 5,7 (ΔpH på 0,6 från och med 6,3), 5,4 (ΔpH på 0,9 från och med 6,3) respektive 5,6 (ΔpH på 0,7 från och med 6,3). När kulturen bestrålades med 68 AMeV och en dos av 20 Gy (kompletterat med 7,2 g-L-1 smörsyra) (figur 2B2) sjönk pH-värdet till omkring 4,4 (ΔpH på 0,9 från och med 6,3), medan det vid en dos av 30 Gy (kompletterat med 7,2 g-L-1 smörsyra) sjönk till omkring 4,4 (ΔpH på 0,9 från och med 6,3).2 g-L-1 smörsyra) (figur 2C2) och en dos på 40 Gy (kompletterat med 7,2 g-L-1 smörsyra) (figur 2D2) var pH-värdena omkring 4,6 (ΔpH på 1,7 från och med 6,3) respektive 4,8 (ΔpH på 1,5 från och med 6,3). När kulturen bestrålades med 114 AMeV och en dos på 40 Gy (kompletterad med 10,8 g-L-1 smörsyra) (figur 2E3) sjönk pH-värdet till 5,9 (ΔpH på 0,4 från 6,3), medan pH-värdena vid en dos på 30 Gy (kompletterad med 10,8 g-L-1 smörsyra) (figur 2F3) och en dos på 40 Gy (kompletterad med 10,8 g-L-1 smörsyra) (figur 2G3) låg på ca 6.0 (ΔpH på 0,3 från 6,3) respektive 5,8 (ΔpH på 0,5 från 6,3).
Tidsförloppet för aktiviteterna hos celler av vildtyp och bestrålade celler som en funktion av tillsatta smörsyrakoncentrationer under de första 54 timmarna av fermenteringen. (A) Celltillväxt hos vildtypstammarna, opåverkad av tillsatsen av butyrat (kontrollkulturer). (B-D) Celltillväxt hos de bestrålade stammarna (energi 68 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy), opåverkad av tillsats av butyrat (kontrollkulturer). (E,F) Celltillväxt hos de bestrålade stammarna (energi 114 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy), opåverkad av tillsats av butyrat (kontrollkulturer). ( A1-A3) Effekterna av tillsatt butyrat på celltillväxt av vildtyp. Enskilda batchkulturer utfördes i kemiskt definierat P2-medium (utfört i serumflaskor) innehållande glukos (ca 42 g-L-1) och kompletterat med 3,6 (A1), 7,2 (A2) och 10,8 g-L-1 (A3) smörsyra. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) Effekten av tillsatt butyrat på de bestrålade cellernas tillväxt (energi 114 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy). Enskilda batchkulturer utfördes i kemiskt definierat P2-medium (utfört i serumflaskor) innehållande glukos (ca 42 g-L-1) och kompletterat med 3,6 (X1), 7,2 (X2) och 10,8 g-L-1 (X3) smörsyra. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Effekterna av tillsatt butyrat på de bestrålade cellernas tillväxt (energi 114 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy). Enskilda batchkulturer utfördes i kemiskt definierat P2-medium (utfört i serumflaskor) innehållande glukos (ca 42 g-L-1) och kompletterat med 3,6 (X1), 7,2 (X2) och 10,8 g-L-1 (X3) smörsyra.
Dessa skillnader i pH reglerar det tidsmässiga skiftet som är kopplat till bildandet av lösningsmedel för varje bestrålad stam. Detta tyder på att vildtypstammarna och de bestrålade stammarna uppvisade ett bifasiskt metaboliskt mönster som starkt påverkades av mediets pH. Som en allmän trend förbrukade cellerna inledningsvis glukos för att stödja tillväxten och producera och utsöndra organiska syror (butyrat och acetat) som primära metaboliter (acidogenes), vilket orsakade en minskning av mediets pH när de ackumulerades till vissa nivåer. Denna ökning av surhetsgraden i buljongen försköt bildningen av syror mot produktionen av lösningsmedel när kulturen nådde den stationära fasen av celltillväxten (lösningsmedelsogenes). Vid högt pH bildas huvudsakligen organiska syror, medan produktionen av lösningsmedel stimuleras vid lågt pH. Som förväntat var arten av den metaboliska förskjutningen och det kinetiska mönstret för bildning av lösningsmedel stamberoende, med tanke på att bestrålade stammar uppvisade sina egna inneboende genetiska och metaboliska egenskaper. Butyrsyra har tidigare rapporterats hämma celltillväxten . Resultaten visade att det i vildtypstammarna skedde en gradvis hämning av celltillväxten, utan att någon realistisk tillväxt observerades vid smörsyrakoncentrationer över 3,6 g-L-1 . I de bestrålade stammarna fanns det dock ingen gradvis hämning av celltillväxten, och ingen realistisk tillväxt observerades för smörsyrakoncentrationer över 10,8 g-L-1.
För att mer i detalj undersöka effekten av tillsatt butyrat jämfördes celltillväxtprofilerna (baserade på OD-mätningar) för vildtypstammarna och de bestrålade stammarna (figur 2A1-G3) under de första 54 timmarna av fermentationen. Intressant nog förbättrades stammarnas tolerans för smörsyra kraftigt när energin och dosen av 12C6+-jonbestrålning ökades. De metaboliska vägarna för glukosmetabolismen i C. tyrobutyricum ATCC 25755 visas i figur 3. Acetyl-CoA, acetoacetyl-CoA och butyryl-CoA är tre viktiga intermediärer och är av särskilt intresse för fermentering med avseende på potentialen för bildning av olika produkter under acidogenes eller solventogenes. Dessa intermediärer är viktiga förgreningar som styr det metaboliska flödet antingen till syra- eller lösningsmedelsbildning. Som den sista viktiga intermediären initierar butyryl-CoA bildningen av smörsyra/butyrat. Butyrat produceras av PTB:s och BK:s sekventiella aktiviteter. Båda enzymerna är mest aktiva under acidogenes och deras specifika aktiviteter minskar under solventogenes, två gånger för PTB och sex gånger för Buk . Vanligtvis krävs en stark pH-beroende aktivitet med ett in vitro-optimum vid acidogena pH-nivåer på pH 5,5 (optimalt runt pH 4,7) och ett in vivo (endogent) pH högre än 5,5 för att inducera solventogenes. En jämförande analys av dessa diagram visade dock tydligt ett större kluster bestående av stammar som bestrålats med 68 AMeV och 40 Gy och stammar som bestrålats med 114 AMeV och doser på 30 och 40 Gy. De två grupperna visade en mycket likartad övergripande tolerans för ökande butyratkoncentrationer jämfört med vildtypbakterierna.
Metaboliska vägar för glukosmetabolism i Clostridium tyrobutyricum . Enzymerna anges med bokstäver enligt följande: Laktatdehydrogenas, pyruvat-ferredoxinoxidoreduktas, NADH-ferredoxinoxidoreduktas, NADPH-ferredoxinoxidoreduktas, hydrogenas, fosfatacetyltransferas (fosfortransacetylas), acetatkinas, acetaldehyddehydrogenas, etanoldehydrogenas, tiolas (acetyl-CoA acetyltransferas), acetoacetyl-CoA, acetat/butyrat:CoA-transferas; acetoacetatdekarboxylas; 3-hydroxylbutyryl-CoA-dehydrogenas; crotonas; butyryl-CoA-dehydrogenas; fosfatbutyltransferas (fosfobutyrylas); butyratkinas.
Effekt av 12C6+ jonbestrålning på produktion av smörsyra
Börsyraproduktionen hos de bestrålade stammarna förbättrades kraftigt både när det gäller koncentrationen av slutprodukten och avkastningen jämfört med vildtypstammen, vilket visas i figur 4B,E. Den obestrålade (vildtypstam, kontroll) C. tyrobutyricum-kulturen som inokulerades i glukosminimalt medium började konsumera socker nästan omedelbart, och produktionen av smörsyra började 12-18 timmar senare (figur 4A,B). Samma kontrollkultur som inokulerades i clostridial growth medium (CGM) innehållande 60 g-L-1 glukos behövde över 96 timmar för att acklimatisera sig trots att de bestrålade stammarna och fermentationerna av vildtypstammarna testades under samma förhållanden. Den förlängda perioden med minimal metabolism och produktivitet beror på att strålningen (olika parametrar) orsakade en fördröjning av celltillväxtens logfas (figur 4C,F). De bestrålade stammarnas smörsyra-tolerans förbättrades kraftigt, vilket gjorde att de kunde producera mer smörsyra, vilket resulterade i fullständigt glukosutnyttjande och produktion av över 32 g-L-1 smörsyra och liknande nivåer av cellbiomassa. Dessutom ökade förhållandet smörsyra/kontroll från 1,0 för vildtypstammen till 1.52 för stammarna som bestrålats vid 114 AMeV och 40 Gy, 1,37 för stammarna som bestrålats vid 114 AMeV och 30 Gy, 1,41 för stammarna som bestrålats vid 68 AMeV och 40 Gy och 1,31 för stammarna som bestrålats vid 68 AMeV och 30 Gy. Denna trend tyder på att kol- och energiflödet omfördelades i de bestrålade stammarnas metaboliska vägar, vilket också resulterade i betydande förändringar i produktionen av olika jäsningsprodukter. Det bör noteras att produktionen av ättiksyra (data visas inte) planade ut mycket tidigare än butyrat/butyrsyra under fermentationen. Fermenteringarna upphörde när glukos inte längre förbrukades av cellerna på grund av en ackumulering av organiska syror och avfallsprodukter i buljongen, vilket orsakade hämning av celltillväxt och andra aktiviteter. De bestrålade stammarna var dock mer toleranta mot smörsyra, vilket framgår av den mycket högre slutliga butyratkoncentrationen som uppnåddes i fermentationerna med dessa bestrålade stammar jämfört med vildtypen. Detta är inte helt överraskande; som framgår av figur 3 kan den ökade toleransen för smörsyra hos de bestrålade stammarna också tillskrivas det minskade flödet genom butyrat PTA/AK-vägen. Eftersom de bestrålade stammarna inte längre var beroende av PTA/AK-vägen för energiproduktion och överlevnad blev de mindre känsliga för hämning av smörsyra .
Sammanställning av syra- och biomassetorrviktsproduktion av vildtyp och bestrålad C. tyrobutyricum som odlats på glukos (innehållande 60 g-L-1) i clostridietillväxtmedium vid 37°C vid pH 5,5 och 6,0. (A-C) Effekten av 12C6+-jonbestrålning (energi 68 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy) på glukoskoncentrationen, smörsyraproduktionen och biomassans torrvikt. (D-F) Effekten av 12C6+-jonbestrålning (energi 114 AMeV och doser på 20, 30 och 40 Gy) på glukoskoncentrationen, produktionen av smörsyra och biomassans torrvikt. (G) SDS-PAGE av cellproteiner från C. tyrobutyricum. Lane WT: vildtyp; lane 1: celler som bestrålats med 68 AMeV och en dos av 30 Gy; lane 2: celler som bestrålats med 68 AMeV och en dos av 40 Gy; lane 3: celler som bestrålats med 114 AMeV och en dos av 30 Gy; lane 4: vildtyp och celler som bestrålats med 114 AMeV och en dos av 40 Gy; lane MW: proteinmolekylviktsmarkörer.
Induktion av ack- och pta-generna, som kodar för enzymer som är associerade med acetatbildningsvägen, förbättrar signifikant produktionen av smörsyra . För att bättre förstå fermentationskinetiken för glukosmetabolismen efter exponering av C. tyrobutyricum för 12C6+-jonbestrålning och den resulterande skadan på ack- och pta-generna, studerades och jämfördes proteinuttrycket hos vildtyp och bestrålade stammar. Figur 4G visar resultaten från SDS-PAGE. Analysen bekräftade uttrycket av proteinet (molekylvikt, cirka 85 kDa) i fyra bestrålade stammar, med den högsta proteinuttrycksnivån i körfält 4. Mängden av ett cirka 106 kDa-protein var mycket högre för den stam som bestrålades med 114 AMeV och 40 Gy än vildtypstammen. AK och PTA från flera mikroorganismer har karakteriserats, men resultaten visade stora variationer i deras molekylvikt . Enzymaktivitetsanalyser genomfördes därför för att ytterligare studera AK:s, PTA:s och PTB:s roll i de syrabildande vägarna (figur 3). Den metaboliska selektiviteten i C. tyrobutyricum påverkas av tillväxtstadiet, där exponentiellt växande kulturer producerar både smörsyra och ättiksyra, medan långsammare stationär tillväxt tenderar att producera smörsyra . Under logfastillväxten för varje sats togs kulturproverna bort och analyserades för aktiviteten av PTA, PTB och AK i de bestrålade stammarna och vildtypstammarna. De specifika enzymaktiviteterna för PTA, PTB och AK i de bestrålade stammarna (olika fysiska parametrar) undersöktes och deras relativa aktiviteter jämfördes med vildtypstammens. AK-aktiviteten minskade med cirka 47 % för stammarna som bestrålades med 114 AMeV och 40 Gy, 31 % för stammarna som bestrålades med 114 AMeV och 30 Gy och 26 % för stammarna som bestrålades med 68 AMeV och 40 Gy. Jämfört med vildtypstammarna hade stammarna som bestrålades vid 114 AMeV och 40 Gy en lägre AK-aktivitet (47 %) men oväntat högre PTA-aktivitet (129 %), även om PTB-aktiviteterna var likartade. Eftersom de stammar som bestrålades med 114 AMeV hade mycket lägre AK-aktivitet skulle PTA-AK-vägen ha försämrats och de producerade därför mer butyrat (60 g-L-1) från glukos än vildtypstammarna. Som tidigare nämnts kan dessa förstärkningar och förbättringar tillskrivas en ökad tolerans mot butyrathämning och i viss mån det minskade kolflödet genom PTA-AK-vägen, vilket framgår av det ökade butyrat/acetatförhållandet i de bestrålade stammarna.
Effekt av 12C6+bestrålning på syraproduktion och tillväxt hos C. tyrobutyricum
Ett experiment genomfördes i fermentationsläge med glukos som primär kolkälla för att bestämma butyratproduktionskapaciteten hos C. tyrobutyricum ATCC 25755 efter bestrålning. Som framgår av figur 5A,B ökade butyrsyraavkastningen från glukos avsevärt, från 0,43 g-g-1 för vildtypstammarna till 0,56 g-g-1 för den stam som bestrålades vid 68 AMeV och en dos på 30 Gy, 0.59 g-g-1 för stammen som bestrålats vid 68 AMeV och en dos av 40 Gy, 0,63 g-g-1 för stammen som bestrålats vid 114 AMeV och en dos av 30 Gy och 0,66 g-g-1 för stammen som bestrålats vid 114 AMeV och en dos av 40 Gy. Det är värt att notera att butyratutbytet för stammen som bestrålades vid 114 AMeV och en dos av 40 Gy skulle ha varit högre (>0,66 g-g-1) om glukosförbrukningen under fördröjningsfasen hade försummats. Den ättiksyra som producerades av stammen som bestrålades med 68 AMeV och doser på 30 och 40 Gy liknade den från vildtypen. Den ättiksyra som producerades av stammen som bestrålades med 114 AMeV och doser på 30 och 40 Gy minskade dock jämfört med den från vildtypen. Som framgår av figur 5B minskade ättiksyrautbytet från glukos också avsevärt, från cirka 0,11 g-g-1 för vildtypstammen till cirka 0,08 g-g-1 för stammen som bestrålats med 114 AMeV och 30 Gy, och cirka 0,07 g-g-1 för stammen som bestrålats med 114 AMeV och 40 Gy. Ändå ökade butyrat/acetatförhållandet (g/g) från 3,99 för vildtypstammen till 5,82 för de bestrålade stammarna, vilket är en tydlig indikation på att de metaboliska vägarna i de bestrålade stammarna ändrades för att gynna produktion av smörsyra framför produktion av ättiksyra. Som framgår av figur 3, eftersom AK- och PTA-aktiviteterna minskade betydligt i de bestrålade stammarna, måste mer pyruvat ha kataboliserats genom den butyratproducerande vägen, vilket ledde till högre butyratutbyte från glukos. Dessutom kan smörsyra också ha främjat en tidigare övergång till den syraproducerande vägen, vilket kan återspeglas i en långsammare tillväxthastighet. Av samma anledning hade de bestrålade proverna en långsammare tillväxthastighet eftersom mindre ATP producerades från den acetatproducerande vägen (PTA-AK), som normalt kan generera mer ATP per mol metaboliserad glukos än den butyratproducerande vägen (PTB-BK) .
Genomgång av syraproduktion för celler av vildtyp och bestrålade C. tyrobutyricum. (A) Produktionen av smörsyra och ättiksyra uppskattades från lutningarna i de linjära plottarna för vildtypcellerna och cellerna som bestrålades med 68 AMeV och doser på 30 och 40 Gy. (B) Produktionen av smörsyra och ättiksyra uppskattades från lutningarna i de linjära kurvorna för vildtypcellerna och cellerna som bestrålades med 114 AMeV och doser på 30 och 40 Gy. (C) Linjärisering (integration) av de kinetiska tillväxtprofilerna för biomassans torrvikt över tiden med hjälp av en naturlig logaritmtransformation. Den maximala specifika tillväxten för vildtypcellerna och de bestrålade cellerna beräknades enligt det exempel som gavs för cellerna som bestrålades med 114 AMeV och en dos av 40 Gy och som odlades i tillväxtmedium för Clostridium som innehöll 60 g-L-1 glukos. BDW, biomassans torrvikt.
En plott av μ max bestämdes sedan vid höga koncentrationer av initial glukos (40, 60, 80 och 120 g-L-1) genom att anpassa jäsningsdata till förutsägelserna från modellsimuleringen. Linjärisering (integration) av de kinetiska tillväxtprofilerna för biomassans torrvikt (BDW) över tiden uppnåddes med hjälp av den naturliga logaritmtransformationen:
Där x(t) = BDW-koncentrationen vid varje tidpunkt x 0 ; t = ursprunglig BDW-koncentration; μ max = maximal specifik tillväxthastighet (h-1); och den specifika tillväxthastigheten är μ = (1/x(t)) – (dx/dt). Av förenklingsskäl antogs det att alla bakterier följde den exponentiella lagen för celltillväxt i en batchkultur i enlighet med en kinetisk modell av första ordningen . Cellernas specifika tillväxthastighet, eller ökningen av cellmassan över tiden, representerar en förskjutning av selektiviteten vid olika tillväxthastigheter, vilket har en betydande inverkan på jäsningsprocessen . Snabb celltillväxt har ett högre energibehov och producerar företrädesvis ättiksyra. Vid låg tillväxttakt gynnas produktionen av smörsyra framför ättiksyra . Vid kontinuerlig jäsning är produktionen av butyrat/smörsyra högre när μ är lägre. När μ närmar sig noll uppstår en svängning i produktiviteten . Dessa ekvationer gör det möjligt att jämföra tillväxthastigheten i batch- och kontinuerliga system inom vildtypen och de strålade stammarna.
Modellen är inte medieoberoende: det medium som används enligt beskrivningen ovan påverkar både celltillväxthastigheten och de producerade mängderna butyrat/smörsyra, och olika profiler för glukosförbrukning skulle ge olika resultat. För att bättre kvantifiera den optimala glukoskoncentrationen för celltillväxten bestämdes den maximala specifika tillväxthastigheten för vildtypstammarna och de bestrålade stammarna från kinetiska data tagna från den exponentiella tillväxtfasen och plottades mot koncentrationen av tillsatt glukos. Som framgår av figur 5C beräknades den maximala specifika tillväxten för stammarna som bestrålades med 114 AMeV och en dos på 40 Gy enligt exemplet där stammen odlades i CGM-medium som innehöll 60 g-L-1 glukos. Det bästa linjära intervallet av datapunkter valdes som motsvarade stammens exponentiella tillväxtfas. I vissa fall, när minimikravet på tre experimentella datapunkter inte uppfylldes, användes ett alternativt uttryck som endast tog hänsyn till två extrema punkter (i början och i slutet av den exponentiella fasen). Den raka linjens lutning (m = μmax) ger den maximala specifika tillväxten (0,213 h-1). Den unära linjära regressionsmodellen (y = 0,2129x – 2,6457) hade en justerad bestämningskoefficient på R2 = 0,9765, vilket visar att alla datapunkter fanns med på linjen för bästa anpassning och att inga datapunkter varierade från denna linje. Dessutom uppskattades varje specifik tillväxthastighet utifrån lutningen på motsvarande semilogaritmisk plott av BDW i förhållande till tiden. Felstaplarna uttrycks i form av standardavvikelsen (SD) som erhållits från beräkningar av varje oberoende jäsningsreplikat för de bestrålade stammarna och vildtypen (originaldata visas inte). Resultaten visar att dessa bestrålade stammar hade en betydligt lägre specifik tillväxthastighet (μ = 0,38 ±0,03 till 0,21 ±0,02 h-1) jämfört med vildtypen (μ = 0,38 till 0,42 h-1). Användning av 12C6+-jonbestrålning vid 68 AMeV, 20-40 Gy och 106-108 joner-puls-1 resulterade i särskilt långa fördröjningsfaser på 10, 12 respektive 16 timmar. Som jämförelse kan nämnas att 12C6+-jonbestrålning vid 114 AMeV, 20-40 Gy och 106-108 jonpulser-1 resulterade i eftersläpningsfaser på 12, 18 respektive 24 timmar. Dessa längre fördröjningsfaser kan delvis tillskrivas de olika strålningsparametrarna och den låga inokuleringsdensitet som användes vid fermenteringen. Den lägre specifika tillväxten för de bestrålade cellerna kan vara ett resultat av den metaboliska belastning som cellerna utsätts för till följd av den lägre energimängd som genereras av glukosmetabolismen på grund av de skador som uppstår vid högre energi och doser. Jämfört med vildtypstammarna hade de 20 och 30 Gy bestrålade stammarna vid 68 AMeV liknande profiler för tillväxt och glukosförbrukning, med en nästan identisk specifik tillväxthastighet på μ = 0,42 ±0 %.03 h-1, medan de 30 och 40 Gy bestrålade stammarna vid 114 AMeV uppvisade en betydligt längre fördröjningsfas, långsammare glukosförbrukning och en mycket lägre specifik tillväxthastighet på μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) och μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Som tidigare nämnts syntetiseras acetat via PTA- och AK-reaktioner, där den senare reaktionen ger ATP (figur 3). För biosyntesen av butyrat kondenseras två molekyler acetyl-CoA till acetoacetyl-CoA, följt av en reduktion till butyryl-CoA, som sedan omvandlas till butyrat via PTB- och BK-reaktioner med ATP-generering. Den lägre specifika tillväxten för de bestrålade stammarna (energi 114 AMeV och doser på 30 och 40 Gy) kan tillskrivas den metabola belastningen på cellerna som orsakas av mindre energiproduktion (ATP) under glukosmetabolismen på grund av strålningsskador på ack och pta. BDW från glukos för de bestrålade stammarna varierade också från vildtypstammarna. Plotten av BDW i förhållande till tid och specifik tillväxthastighet för de bestrålade stammarna visade att kol- och energiflödet omfördelades i alla metaboliska vägar hos dessa stammar, vilket också resulterade i betydande förändringar i syraproduktionen av jäsningsprodukter.