Struktur av humant lysosomalt α-glukosidas – en vägledning för behandling av Pompes sjukdom

Strukturell översikt

GAA syntetiseras som ett 110 kDa glykoprotein, som riktas till lysosomen via mannose-6-fosfatreceptorn och genomgår i det sena endosomala/lysosomala kompartmentet en rad proteolytiska och N-glykanbearbetningshändelser för att ge en mogen aktiv form som består av fyra tätt associerade peptider19,20. Eftersom kristallisering av den kommersiella Myozyme®-prekursorformen av rhGAA (Q57-C952) inte gav kristaller som diffrakterade bortom ~7 Å och proteinstörningsprediktorer21 indikerade förekomsten av oordnade peptidregioner, utförde vi in situ-proteolys med α-chymotrypsin för att avlägsna förmodade flexibla ytloopar som hindrar bildandet av produktiva kristallkontakter. Den proteolytiska behandlingen gav en polypeptid med ~5 kDa lägre massa än rhGAA-prekursorn (fig. 2a), som kristalliserades lätt. Detta gjorde det möjligt för oss att samla in diffraktionsdata som sträckte sig till 1,9 Å och lösa rhGAA:s struktur genom molekylär ersättning (tabell 1). Den proteolytiskt smälta formen hade en aktivitet som var jämförbar med prekursorns (2,34 ± 0,06 och 2,26 ± 0,16 U mg-1 för prekursorn respektive den mogna formen), vilket tyder på att α-chymotrypsinbehandlingen inte förändrade rhGAA:s funktionalitet.

Kristallstrukturen av rhGAA motsvarar den mogna formen av humant placentärt GAA och rhGAA20 (fig. 2b), vilket tyder på att behandling med α-chymotrypsin möjliggjorde avlägsnande av proteaselabila regioner (Q57-T80, G116-M122, R199-A204 och A782-R794) på ett sätt som är jämförbart med den proteolytiska mognad som sker in vivo. Den övergripande arkitekturen hos rhGAA liknar den hos homologerna av GH311 från den humana glykosidhydrolasfamiljen, de intestinala borstgränsenzymerna maltas-glukoamylas (MGAM)22,23 och sucrase-isomaltas (SI)24 (fig. 2c och kompletterande fig. 1). En N-terminal trefoil typ-P-domän följs av en β-bladdomän, den katalytiska (β/α)8-fatronen som bär två instick efter β-strängar β3 (instick I) och β4 (instick II) samt proximala och distala β-bladdomäner vid C-terminalen. Prekursorformen av rhGAA innehåller ~14 kDa kolhydrat och sju glykosyleringsställen har förutsetts och karakteriserats20. Vi observerade glykanstrukturer av olika längd för fem av dem i kristallstrukturen, särskilt vid N140, N233, N390, N470 och N652 (fig. 2c och kompletterande fig. 2). Vi upptäckte resterande differenselektrontäthet vid N882, otillräcklig för att modellera en glykanstruktur, och observerade inte differenselektrontäthet nära N925.

Aktivt område och inhibitorbindning

Den smala substratbindningsfickan hos rhGAA är belägen nära de C-terminala ändarna av β-strängarna i den katalytiska (β/α)8-domänen och formad av en slinga från den N-terminala β-bladsdomänen och de båda inläggen I och II (fig. 2c). Enzymer i familjen GH31 utför katalys via en klassisk Koshland-reaktionsmekanism med dubbel förskjutning med bibehållande av den anomeriska kolkonfigurationen i produkten. Från tidig karakterisering av den katalytiska platsen för GAA25 och genom homologi med mekanistiskt dissekerade medlemmar av familjen GH3126,27 kan den katalytiska nukleofilen och syran/basen tilldelas D518 respektive D616. För att få en inblick i rhGAA:s interaktion med den dokumenterade farmakologiska chaperonen 1-deoxynojirimycin16,28 och dess derivat N-hydroxyetyl-deoxynojirimycin29 (DNJ respektive NHE-DNJ), blötläggde vi rhGAA-kristaller med dessa aktivitetsställeinriktade iminosockerinhibitorer och erhöll för båda komplexen diffraktionsdata som sträcker sig till en upplösning på 2,0 Å (tabell 1). DNJ binds i en 4C1-konformation i den substratbindande subplatsen -130 och stabiliseras av vätebindningar till sidokedjorna av D404, D518, R600, D616 och H674. Ytterligare stabiliserande interaktioner tillhandahålls av hydrofoba kontakter med W376, I441, W516, M519, W613 och F649 (fig. 3a, b). Bortsett från en 20° lutning i W376:s sidokedja sker inga större konformationsförändringar vid DNJ-bindning i rhGAA:s aktiva plats. Detta är inte fallet vid bindning av NHE-DNJ, som intar samma position som DNJ, men där hydroxyetylsubstituenten inducerar betydande konformationsförändringar i M519:s och W481:s sidokedjor (fig. 3c, d). I denna ligandinducerade konformation etablerar rhGAA-residens W481, som är belägen på spetsen av insert I, en stabiliserande interaktion med hydroxyetylsubstituenten i NHE-DNJ. Liknande konformationsförändringar kan observeras vid bindning av NHE-DNJ till den N-terminala underenheten av MGAM (NtMGAM)31 (Supplementary Fig. 3a).

Substratigenkänning och specificitet

För att samla in en uppfattning om substratigenkänning av rhGAA förvärvade vi diffraktionsdata som sträcker sig till en upplösning på 2,45 Å för en rhGAA-kristall som blötts upp med acarbose, en icke-spjälkningsbar α-1,4-tetrasackaridsubstratanalog (tabell 1). I detta komplex antar valienaminringen som är inlagd i subsite -1 en 2H3 halvkärningskonformation, men trots denna konformationsskillnad i förhållande till DNJ som är bunden i 4C1 halvkärningskonformationen är vätebindningsmönstret i subsite -1 i stort sett identiskt för de två föreningarna (fig. 3e, f och kompletterande fig. 3b). Det icke hydrolyserbara ”interglykosidiska” kvävet upptar det katalytiska centret och är vätebundet till den katalytiska syran/basen D616. 6-deoxyglukosyldelen i subsite + 1 etablerar via sina 2- och 3-hydroxylgrupper vätebindningar med den bevarade R600 och med D282 som härrör från en slinga i den N-terminala β-bladdomänen. Även om de inte är konserverade i sekvensen interagerar resterna i denna slinga undantagslöst med kolhydratligander i alla tillgängliga kristallstrukturer av medlemmarna i familjen GH31. Maltosenheten i acarbose i subsites + 2 och + 3 gör inga direkta interaktioner med rhGAA och stabiliseras snarare av kristallgitterets packningsinteraktioner och en vattenmedierad kontakt med W618:s sidokedja, som är belägen vid kanten av den substratbindande fickan. Denna brist på interaktioner tyder på att rhGAA endast har två produktiva substratbindningsställen, subsites -1 och + 1, men intressant nog antar acarbose-maltose-delen som är bunden till rhGAA samma övergripande position som när den är bunden till NtMGAM22, vilket tyder på en funktionell roll även för subsites + 2 och + 3 i rhGAA (Supplementary Fig. 3c).

Glykogen är en stor polymer som byggs upp av linjära kedjor av α-1,4-bundna glukosrester som bär α-1,6-bundna grenar. I cytosolen bryts energilagringspartikeln ner genom samtidig verkan av glykogenfosforylas och ett förgreningsenzym. I lysosomen finns inget avgreningsenzym och GAA måste säkerställa hydrolysen av både α-1,4- och α-1,6-glykosidiska bindningar. RhGAA visar dock en tydlig preferens för den förstnämnda bindningen, eftersom specificitetskonstanten för maltos är 32 gånger högre jämfört med specificitetskonstanten för isomaltos (kompletterande tabell 2). För att avslöja den strukturella grunden för den dubbla substratspecificiteten försökte vi blötlägga rhGAA-kristaller med den icke hydrolyserbara tetrasackariden glucopyranosyl-α-(1,6)-thio-maltotrios. Detta tillvägagångssätt misslyckades dock, sannolikt på grund av att kristallkontakter hindrar ackommodation av tetrasackariden, som i kraft av α-1,6-bindningen är något längre än acarbose. Det senare har observerats att det knappt passar in i den substratbindande klyftan och ligger tätt intill en symmetribesläktad molekyl (fig. 3e). Vi härledde en α-1,6-bunden disackarid som är bunden inom den aktiva platsen för rhGAA genom en strukturell superposition av rhGAA med den katalytiska (β/α)8-domänen av Blautia obeum GAA i komplex med isomaltos32 (rmsd på 1,50 Å för 318 alignade Cα-positioner). Modellen visar att inget steriskt hinder uppstår genom ackommodation av en α-1,6-bindning mellan subsite -1 och + 1 och att produktiva vätebindningar mellan glykopyranosdelen i subsite + 1 och D282 bibehålls (fig. 4a, b). På grund av den ökade längden på α-1,6-bindningen jämfört med en α-1,4-bindning försvagas dock den stabiliserande vätebindningen med R600, vilket kan förklara enzymets lägre aktivitet på α-1,6-bindade grenar.

Den sekundära substratbindande domänen

I rhGAA-acarbosskomplexet kunde vi observera att acarvosindelen av en andra acarbossmolekyl var inlagd i en ficka i den N-terminala trefoil-typ-P-domänen, belägen på samma sida av rhGAA som den aktiva platsen är belägen på, och 25 Å från den acarbos som är bunden i den (fig. 4c). Valienaminkomponenten vätebinds med sina 4- och 6-hydroxylgrupper till huvudkedjans kväve och syre i C127, huvudkedjans syre i A93 och sidokedjan i D91. Ytterligare stabiliserande interaktioner tillhandahålls av staplingsinteraktioner med P125 och W126. P125 och D91 är bevarade eller ersatta med konservativa substitutioner i GH31-familjens enzymer som består av en trefoil typ-P-domän (kompletterande figur 4a). I anslutning till den sekundära kolhydratbindningsplatsen hade ytslingan G116-M122 trimmats genom proteolytisk behandling. Det är tänkbart att avlägsnandet av segmentet G116-M122, som är unikt för de lysosomala företrädarna för familjen GH31 (kompletterande figur 4a och b), kan bidra till bildandet av den sekundära substratbindningsfickan. Man skulle kunna tänka sig att den sekundära acarbosbindningsstället på rhGAA utgör ett genuint substratbindningsställe som möjligen kan öka enzymets processivitet. Denna plats skulle också kunna utgöra en farmakofore för in silico-screening av nya farmakologiska chaperoner. Framför allt är en trisackarid som härrör från acarbose bunden till den N-terminala domänen för α-1,4-glukanlyas av familjen GH31 från Gracilariopsis lemaneiformis 33 i en position nära den sekundära substratbindningsstället som beskrivs här (kompletterande figur 5).

N-acetylcystein är en allosterisk farmakologisk chaperon

Det kända läkemedlet N-acetylcystein (NAC) har visat sig fungera som en allosterisk farmakologisk chaperon som förbättrar stabiliteten hos muterad endogen GAA och rhGAA som används för ERT, utan att påverka den katalytiska aktiviteten18. För att utnyttja den terapeutiska potentialen hos NAC för Pompes sjukdom genom strukturstudier har vi undersökt kristallstrukturen av rhGAA i komplex med NAC. Den struktur med en upplösning på 1,83 Å av komplexet som erhållits genom experiment med kristallinläggning (tabell 1) avslöjar två NAC-bindningsställen på avstånd från den aktiva platsen (fig. 4d, e), vilket ger strukturella bevis för att NAC verkligen är en allosterisk chaperon, vilket förväntades av funktionella studier18. Vi har genom aktivitetsanalyser och differential scanning fluorimetri säkerställt att NAC stabiliserar lika bra rhGAA och det proteolytiskt mognade enzymet som producerades i denna studie, och att chaperonen är specifik för GAA, eftersom NAC inte har någon stabiliserande effekt på en GH31-homolog från ris (kompletterande fig. 6a, b och kompletterande tabellerna 3 och 4). I rhGAA-NAC-komplexets struktur är en NAC-molekyl, betecknad som NAC1, placerad cirka 30 Å från den aktiva platsen, vid gränssnittet mellan (β/α)8-floden och den distala β-bladdomänen (fig. 4d). NAC1 binder till huvudkedjans karboxyl av H432 via dess amidkväve och karboxylfunktionen gör en vattenmedierad kontakt med sidokedjan av D513. Cβ-Sγ- och acetylgrupperna etablerar staplingsinteraktioner med guanidingruppen i R437 respektive slingan G434-G435. En andra, delvis (75 %) ockuperad NAC-molekyl (NAC2), är placerad vid gränssnittet mellan (β/α)8-floden och den proximala β-bladdomänen på ett avstånd av 25 Å från den aktiva platsen (fig. 4e). Karboxylfunktionen hos NAC2 gör en vattenmedierad kontakt med huvudkedjans syre hos L756, tiolen staplar sig mot sidokedjan hos Q757 och acetylgruppen staplar sig mot sidokedjan hos H742. De två NAC-molekylerna etablerar färre och svagare interaktioner med rhGAA än chaperonerna DNJ och NHE-DNJ. Detta återspeglar de högre koncentrationer av NAC som krävs för chaperonaktivitet (mM vs. µM), vilket exemplifieras av K D på 11,57±0,74 mM som vi erhöll genom differentiell skanningsfluorimetri och av K i på 3,4 och 3,0 µM för DNJ respektive NHE-DNJ18,29. En sigmoidal mättnadskurva som bäst passar in på de experimentella punkterna stöder de allosteriska NAC-bindningsplatserna som är helt (NAC1) och delvis (NAC2) ockuperade (kompletterande figur 6c). De staplingsinteraktioner som etablerats mellan acetylgrupperna i NAC1 och NAC2 och rhGAA måste bidra väsentligt till bindningsenergin, eftersom aminosyror som är besläktade med NAC, t.ex. N-acetylserin och N-acetylglycin, också har en stabiliserande effekt på rhGAA, medan de icke-acetylerade motsvarigheterna inte har någon effekt18. Strukturen för rhGAA-NAC-komplexet visar en minskning av de atomära termiska förskjutningsparametrarna för de rester som omger NAC-bindningsställena i förhållande till den obundna rhGAA, vilket pekar på en övergripande interdomänstabiliserande funktion som drivs av NAC (kompletterande figur 7a-d). I kristallen verkar NAC också utöva en antioxidativ effekt eftersom rest C938 oxideras till sulfensyraformen i alla kristallstrukturer som beskrivs här, med undantag för strukturen av rhGAA-NAC-komplexet (kompletterande fig. 8a, b).

NAC och iminosugar visar olika chaperonprofiler

Vissa mutationer som leder till Pompes sjukdom reagerar på både NAC och iminosugarna DNJ och NB-DNJ, medan andra är specifikt inriktade på den ena eller andra farmakologiska chaperonen16,17,18. Den stora majoriteten av GAA-mutanter som reagerar på iminosugars chaperonaktivitet är belägna antingen inom räckhåll för den aktiva platsen eller på strukturella element som bidrar till dess globala arkitektur. I Pompe-patienter, fibroblaster och musmodeller är de GAA-mutanter som reagerar mest på NAC (A445P, Y455F och L552P)18 belägna på insatserna I och II, där motsvarande vildtyprester bidrar till domänstabiliseringar. A445 tillsammans med F487 definierar gränserna för insats I, och mutanten A445P destabiliserar troligen hela ställningen för insats I (kompletterande figur 9a). Sidokedjans hydroxyl av Y455 på insert I interagerar med en lång slinga av den katalytiska domänen medan sidokedjan av L552 på insert II gör hydrofoba interaktioner med rester från den N-terminala β-bladdomänen (Supplementary Fig. 9b, c). Respektive Y455F- och L552P-mutanter har med största säkerhet en övergripande destabiliserande effekt, som tydligt räddas av NAC. Därför kan iminosockerens chaperonverkan betraktas som en konformationell räddning av strukturellt störda aktiva platser, medan effekten av det allosteriska chaperonet NAC tycks bero på stabilisering av övergripande eller lokala konformationella fluktuationer.