Coronaviruset 2019 (COVID-19) är en infektionssjukdom som har orsakat en global pandemi med mer än 36 miljoner smittade människor i omkring 200 länder eller territorier, med mer än 1 miljon dödsfall hittills (Världshälsoorganisationen (WHO), 2020). Det orsakande agenset till COVID-19, coronavirus 2 med allvarligt akut respiratoriskt syndrom (SARS-CoV-2), antas ha sitt ursprung i fladdermöss, eftersom det fladdermusburna coronaviruset RaTG13 är den närmaste genetiska släktingen till dags dato (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Flera arter har studerats för att fastställa deras potentiella roll som mellanvärdar (Shi et al., 2020). Dessutom anses djurmodeller för att återskapa en COVID-19-liknande sjukdom vara en viktig forskningslinje och krävs för utveckling av terapeutiska läkemedel och profylaktiska föreningar.
Bortsett från flera modellstudier som föreslår potentiella djurarter som är mottagliga för SARS-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020) har flera experimentella infektioner redan visat att det finns ett brett spektrum av mottagliga djur. Specifikt är egyptisk fladdermus, iller, gyllene syrisk hamster, katt, möss som uttrycker humaniserat angiotensin-konverterande enzym 2 (ACE2), BALB/c-möss (med hjälp av ett muterat SARS-CoV-2 genom flera cellodlingspassager) och vissa icke-mänskliga primatarter tillåtande för virusinfektion, som utvecklas från subklinisk till mild till måttlig respiratorisk sjukdom (Bao et al, 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). Ur experimentell synvinkel är hundens känslighet för SARS-CoV-2 begränsad, eftersom inokulerade djur delvis kan serokonvertera (Shi et al., 2020). Däremot resulterade intranasal inokulering av kyckling, anka och gris i inga tecken på infektion (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Svin används ofta i forskning på grund av de likheter som finns med människor när det gäller anatomi, genetik, fysiologi och även immunologi. Faktum är att försök på grisar sannolikt är mer förutsägande för terapeutiska och förebyggande behandlingar hos människor än försök på gnagare (Meurens et al., 2012). Eftersom grisar inte är mottagliga för SARS-CoV-2-infektion när de inokuleras intranasalt (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020) förtjänar möjligheten att utveckla en modell för svininfektion med detta virus med hjälp av andra potentiella inokuleringsvägar att undersökas. Det främsta skälet till att testa grisar är att ACE2-receptorn hos denna art är funktionell, antingen genom att transfektera svinets ACE2 i HeLa-celler (som inte uttrycker det humana ACE2 konstitutivt) (Zhou et al., 2020) eller att pseudopartiklar med S-proteinet från SARS-CoV-2 kan infektera njurceller hos svin (Letko et al., 2020). Dessutom uttrycks ACE2-proteinet i alla större vävnader hos grisar enligt bedömning med immunohistokemi (Xiao et al., 2020). För att inrätta en förmodad COVID-19-grismodell undersökte vi därför effekten av olika naturliga och icke-naturliga vägar för inokulering av SARS-CoV-2 hos tamsvin (Sus scrofa domesticus).
För ändamålet valdes fyra grupper om fem 5- till 6-veckor gamla konventionella smågrisar (Landrace × Large White) ut och inokulerades på olika sätt: intranasalt (IN, 1,5 ml/nostril; total volym 3 ml), intratrakealt (IT, 3 ml) enligt tidigare beskrivning (Garcia-Morante et al, 2016), intramuskulärt (IM, 1 ml i varje sida av nackmusklerna; total volym 2 ml) eller intravenöst (IV, 2 ml), med en slutdos på 105,8 vävnadskulturinfektiös dos (TCID50) av SARS-CoV-2-isolat (GISAID ID EPI_ISL_510689) per djur. IT-gruppen och IV-gruppen sövdes med 10 mg/kg ketamin och 0,8 mg/kg xylazin före inokulering. En passage-2 SARS-CoV-2 förökades och titrerades i Vero E6-celler (ATCC CRL-1586) enligt samma protokoll som för andra coronavirus (Rodon et al., 2019). Två extra grisar användes som negativa kontroller.
Alla djur var seropositiva mot porcint respiratoriskt coronavirus, vilket fastställdes med en kommersiell ELISA (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Med hänsyn till att ingen antikroppskorsreaktivitet mellan alfa- och beta-koronavirus har beskrivits (Okba et al., 2020) behölls djuren i studien. Initial reaktivitet mot PRCV förväntades eftersom detta virus är allestädes närvarande i den europeiska svinbesättningen (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
Djurförsöken godkändes av den institutionella djurskyddskommittén vid Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) och av den etiska kommissionen för djurförsök vid Kataloniens autonoma regering och utfördes av certifierad personal. Försöken med SARS-CoV-2 utfördes på biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3) vid Biocontainment Unit of IRTA-CReSA (Barcelona, Spanien).
2 och 22 dagar efter inokulering (dpi) avlivades två respektive tre djur per grupp (IT, IM och IV). Eftersom IN-inokulering redan visats vara ineffektiv för att orsaka SARS-CoV-2-infektion (Shi et al., 2020), avlivades grisar som inokulerats på detta sätt dag 1 och 2 pi för att bedöma bevis för en eventuell övergående tidig infektion i vävnader. Negativa kontrolldjur avlivades innan försöket inleddes. Proverna samlades in och bearbetades enligt tidigare beskrivning (Vergara-Alert et al., 2017). Kortfattat utfördes fullständiga nekropsier på alla djur. Flera vävnader (främre, mediala och kaudala turbinat; proximal, medial och distal luftstrupe; stora och små bronker, vänster kraniala, mediodorsala och kaudala lungområden; njure; lever; hjärta och mjälte) togs ut, fixerades genom nedsänkning i 10 % neutralt buffrat formalin, bäddades in i paraffin och sektionerades på 3 µm för att förbereda objektglas. Histologiska objektglas färgades med hematoxylin och eosin (HE) för att bedöma eventuella mikroskopiska skador. Dessutom togs samma vävnader plus ileum, cervikal lymfkörtel (LN), mediastinal LN, mesenterisk LN, olfactory bulb, tonsiller, thymus, parotidspottkörtel, binjure, bukspottkörtel, hjärnstam, ögonlock och benmärg i Dulbecco’s modifierat Eagle-medium (DMEM) i rör med pärlor för att utföra detektion av SARS-CoV-2 upE-genen med RT-qPCR (Corman et al., 2020). Näs- och rektalsvabbar togs också (dagligen under den första veckan och vid 14 och 22 dpi) för att analysera dem med avseende på förekomst av viralt RNA med hjälp av ovan nämnda RT-qPCR. Serumprover som samlades in dag 0, 14 och 22 pi testades för förekomst av antikroppar mot SARS-CoV-2 spike S1 + S2 och nukleokapsid (N)-proteiner med hjälp av interna ELISA (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Dessutom utfördes en virusneutraliseringsanalys enligt ett tidigare protokoll med en mindre ändring (Rodon et al., 2020), serieutspädningar av serum och SARS-CoV-2 inkuberades i 1 timme vid 37 °C innan plattanalysen utfördes.
Alla djur övervakades dagligen men inget av dem uppvisade kliniska tecken efter inokulering av SARS-CoV-2. Inga grova eller mikroskopiska skador som kan hänföras till SARS-CoV-2-infektion hittades heller hos något av de undersökta djuren från alla inokulationsgrupper samt kontrollgrupperna (data visas inte).
Ingen av grisarna hade nasal eller rektal utsöndring av viralt RNA. Proximal trakea från ett IN-inokulerat djur var positivt vid 1 dpi för viralt RNA (Cq = 24,36). Resterande vävnader från detta djur och resten av grisarna resulterade negativt för RT-qPCR (qPCR-detektionsgräns på 38,6 cykler).
För 14 och 22 dpi kunde låga nivåer av antikroppar riktade mot Spike-proteinet påvisas hos alla djur från IM- och IV-grupperna (figur 1a). Dessutom uppvisade dessa grisar också neutraliserande antikroppstitrar vid 22 dpi (från 74 till 317 SNT50 reciprok utspädningstiter) (figur 1b). Låga antikroppsnivåer riktade mot N-proteinet hittades också hos ett av tre IM- och alla IV-inokulerade djur i slutet av försöket (data visas inte). Det är viktigt att notera att ett enda djur från IT-gruppen inte uppvisade antikroppar mot S-proteinet men hade antikroppar mot N-proteinet samt neutraliserande titrar (SNT50 reciprok utspädningstiter på 29) vid dag 0 pi, vilket kan tyda på en potentiell korsreaktion med ett annat coronavirus som infekterar svin. Noterbart är att dessa antikroppar mot N-proteinet minskade när försöket avslutades, vilket tyder på att de var av maternellt ursprung. Dessutom uppvisade detta djur inga seroneutraliserande antikroppar vid 22 dpi (figur 1b).
Föreliggande data tyder på att SARS-CoV-2 inte kunde infektera grisar via någon av de testade vägarna, nämligen IN, IT, IM och IV. Därför bekräftar våra ansträngningar tidigare experiment som visar på bristande känslighet för infektion hos gris (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), även om det kan användas för att bedöma immunogeniciteten hos de kommande vaccinkandidaterna.
Viktigt nog går den aktuella studien längre än andra studier med SARS-CoV-2 och grisar eftersom vi testade ett bredare antal inokulationsvägar. Ingen av dem resulterade dock i en produktiv infektion hos smågrisar. Ett viktigt resultat av denna studie var bevis för serokonversion mot Spike-glykoproteinet vid dag 14 och 22 pi och förekomst av neutraliserande antikroppar vid dag 22 pi hos grisar som inokulerats via parenterala vägar (IM och IV). Med tanke på försökets korta varaktighet (22 dagar) understryker en sådan serokonversion grisens potentiella intresse att användas i immunogenicitetsstudier av SARS-CoV-2. Faktum är att intresset för svin som en lämplig djurmodell för immunologi samt fysiologi, farmakologi och kirurgi som kan tillämpas inom humanmedicinen är allmänt erkänt (Rothkötter, 2009).
Slutsatsen är att denna studie bekräftar att smågrisar inte är en lämplig djurmodell för COVID-19, men dess potentiella användbarhet som modell för immunogenicitet i prekliniska studier för utveckling av vaccin förtjänar ytterligare undersökningar.