Sammanfattning
Utrocentrifugering med densitetsgradient av sackaros är en kraftfull teknik för fraktionering av makromolekyler som DNA, RNA och proteiner. För detta ändamål läggs ett prov som innehåller en blandning av makromolekyler av olika storlek i lager på ytan av en gradient vars densitet ökar linjärt från toppen till botten. Under centrifugering sedimenterar makromolekyler av olika storlek genom gradienten med olika hastighet. Sedimentationshastigheten beror förutom på centrifugalkraften även på makromolekylernas storlek, form och densitet samt på gradientens densitet och viskositet. På detta sätt separeras makromolekylerna efter storlek, där större makromolekyler sedimenterar mot botten och lättare makromolekyler stannar kvar nära gradientens topp. Metoden har varit särskilt framgångsrik när det gäller storleksfraktionering av stora DNA-molekyler och har använts flitigt för att mäta induktion och reparation av DNA-brott efter exponering för klastogena faktorer. Här beskriver vi en anpassning av denna metod som kan användas för analys av nysyntetiserat DNA som bildas under DNA-replikation. Genom storleksanalys av nyskapat DNA i alkaliska sackarosgradienter kan variationer i replikationsaktiviteten mätas efter exponering av celler för DNA-skadande ämnen. Metoden är särskilt användbar eftersom den gör det möjligt att skilja mellan DNA-skador-medierade effekter på kedjeförlängning respektive replikoninitiering, vilket är viktigt för en djupgående analys av kontrollpunkten inom S-fasen. Denna förmåga gör tekniken unik och motiverar dess något arbetskrävande karaktär.